[绿色荧光蛋白的研究现状与应用] 绿色荧光蛋白的应用

　　【摘 要】绿色荧光蛋白（GFP）最早发现于水母体中，是一种十分重要的蛋白质。由于其众多的优点，现已在分子生物和细胞生物的研究中应用十分广泛。随着技术的进步和研究的进一步深入，GFP基因也在许多其他方面将发挥着越来越重要的作用。
　　【关键词】绿色荧光蛋白；生色团；报告基因
　　2008年10月8日，瑞典皇家科学院诺贝尔奖委员会授予三位科学家：日裔美国科学家下村修(Osamu Shimomura)、美国科学家马丁?查尔非(Martin Chalfie)和美国华裔科学家钱永健(Roger Y．Tsien)诺贝尔化学奖，以表彰他们在绿色荧光蛋白(GFP)研究方面做出的突出贡献。
　　1 绿色荧光蛋白的理论研究
　　1.1绿色荧光蛋白的发现
　　绿色荧光蛋白最早于1962年在维多利亚多管发光水母体内被发现，同时它也存在于水螅和珊瑚等腔肠动物体内。它的内源基团可以在蓝光或紫外光激发下发射绿光，属于生物发光蛋白。绿色荧光蛋白在水母体内之所以能发光，主要依靠水母素的辅助。水母素和GFP之间能发生了能量转移，在钙的刺激下，其能量可转移到GFP，刺激GFP发光。
　　1.2绿色荧光蛋白的结构和发光原理
　　1992年Prasher等克隆了GFP基因的cDNA并分析了其一级结构。野生型GFP基因组全长2600bp，由3个外显子和2个内含子组成，编码238个氨基酸，分子量约28kDa。GFP的三维立体结构是由11个β折叠围在四周形成一个中空的圆柱体，1条α折叠贯穿在圆柱体的中间，其中有一段位于65-67位的3个氨基酸残基（Ser-Tyr-Gly）形成的杂环咪唑啉结构组成生色团，位于圆筒中央并附着在α螺旋上。绿色荧光蛋白的发光原理是位于氨基酸第65位的Ser的羧基和67位的Gly的酰基经过亲核反应生成咪唑基，66位的Tyr通过脱氢使芳香团与咪唑基结合，形成对羟基苯甲酸咪唑环酮生色团发出荧光。GFP的最大和次大的激发波长分别是395nm和475nm。溶液中，395nm激发的荧光发射峰在508nm，375nm激发的荧光发射峰在503nm。
　　1.3绿色荧光蛋白的优点
　　绿色荧光蛋白的独特之处即它的优点很多，主要有：荧光反应不需要底物和任何其他辅助因子，只需要在蓝光和紫外光下照射，利用荧光显微镜甚至是直接用肉眼就可以观察，易于检测且灵敏度高；荧光性质稳定，对光漂白有较强的耐受性；无毒害，转化后细胞仍可连续传代；通用性好，无种属特异性；分子量小，易于构建载体；不受假阳性干扰，结果真实可靠；可进行活细胞定时定位观察；易于得到突变体。
　　2 绿色荧光蛋白的应用
　　1994年Chalfie等首次在大肠杆菌细胞和线虫中表达了GFP，开创了GFP应用研究的先河。也正是由于绿色荧光蛋白的许多优点，使得其应用十分广泛。
　　2.1作为报告基因
　　GFP通常用作报告基因，可用来检测转基因效率，把GFP基因连接到目的基因的启动子之后，通过测定GFP的荧光强度就可以对该基因的表达水平进行检测。GFP最显著的优势是荧光反应不需要底物和其他辅助因子。有利必有弊，它最大的缺点是没有放大功能，不能像酶分子一样将信号放大，所以一般需要启动子驱动GFP基因在细胞内可以足量表达。目前，此方法无论在农杆菌介导或基因枪介导的植物遗传转化中还是在活细胞、转基因胚胎和动物中都已得到非常广泛的应用。
　　2.2作为融合标签
　　通过基因工程等生物学技术，GFP基因可以与外源基因融合构成嵌合基因。其表达产物既保持了外源蛋白的生物活性，又表现出与天然GFP相似的荧光特性。GFP的这种特性为蛋白质提供了一种荧光标记，不仅可以检测蛋白质分子的定位、迁移，还可以研究蛋白质分子的相互作用以及蛋白质构象变化，并依靠荧光共振能量转移来进行检测。
　　2.3其他
　　GFP还有其他重要应用：(1)研究基因表达的调控元件；(2)研究基因表达的时序控制与空间定位；(3)发育分子机理研究，GFP可以作为活体标记，在原位观察细胞的生长和运动。特别对于身体透明的动物观察起来更方便；(4)药物筛选，由于可以用不同颜色的GFP衍生物标记相关的蛋白来观察单细胞内相互作用的靶蛋白，再分离出目的细胞，从而可用于大规模药物筛选；(5)临床检验，生产出GFP标记的抗原或抗体，就可以免疫诊断；(6)转基因动物和植物的筛选标记，微生物在体内的感染途径，病毒和宿主的相互作用等，如将其插入动物、细菌或细胞的遗传信息中，随着细胞复制，可观察不断长大的癌症肿瘤、细菌的生长；(7)作为生物传感器，野生型和多种突变型GFP都有依赖pH的荧光变化，因而可以被用来检测活细胞内的pH等等。
　　3 绿色荧光蛋白的优化和改造
　　天然的GFP的荧光强度低，表达易受温度的影响，翻译合成后的蛋白质构象折叠的效率低，而且具有多个吸收峰。为了使得GFP在应用时具有更好的特性，通过生物学方法对GFP进行了优化和改造。一般是更换生色团的氨基酸。通过基因突变将第65位的Ser点突变为Thr，这样可以增强荧光强度，而且可以优化单个吸收峰。Chalfie等科学家，还对GFP的颜色进行了改造，以扩大其用途。由GFP改造而成的变体以及GFP本身，覆盖了从蓝色到黄色的光谱范围，按其发射波长由短至长可分为蓝色（BFP）、青色（CFP)、绿色（GFP）、黄绿色（YFP）四大组，这些也都是通过对生色团的氨基酸进行点突变，例如野生型的绿色发光位点为Ser—Tyr—Gly，蓝色为Ser—His—Gly，青色为Thr—Trp—Gly，黄绿色为Gly—Tyr—Gly。
　　4 展望
　　随着分子生物学技术的发展，对GFP的理论研究进一步加深，GFP基因在启动子分析、抗病检测和细胞筛选等方面的应用也越来越广泛。目前虽然仍有一些还未解决的难题，但随着技术的进步以及科研人员的进一步探索，有理由相信GFP将在未来的生物学领域发挥越来越重要的贡献。
　　参考文献
　　[1]何琪杨，张鸿卿．薛绍白．国外医学分子生物学分册．1997，19：279—283
　　[2]赵华，粱婉琪，杨永华等．植物生理学通讯．2003，39：171—178