密码子 氨基酸_96-改善稀有密码子和氨基酸残基限制提高重组人ADAM15

Research Paper 研究报告

微生物学报Acta Microbiologica Sinica 48(8)：1067~1074; 4 August 2008 ISSN 0001-6209; CN11-1995/Q .cn

改善稀有密码子和氨基酸残基限制提高重组人ADAM15

去整合素结构域蛋白表达水平

吴静1,2，雷楗勇1，张莲芬1,2，花慧1，金坚1, 2*

（1工业生物技术教育部重点实验室，2江南大学医药学院分子药理研究室，无锡 214122）

摘要：【目的】为提高重组人ADAM (A Disintegrin And Metalloproteinase) 15 去整合素结构域蛋白(rhADAM15)的表达水平。【方法】在详尽分析rhADAM15的cDNA和GST(谷胱甘肽-S-转移【结果】(1)选择能为大肠杆酶)-ADAM15结构的基础上，选择表达宿主菌并对表达质粒进行改造。

菌稀有密码子提供额外tRNA的Escherichia coli. Rosetta(DE3)作为宿主菌，将质粒pGEX-ADAM15转化于其中在最佳诱导表达条件下获得298 mg/L融合蛋白GST-ADAM15；(2) 采用PCR体外定点突变技术将目标蛋白编码区稀有密码子GGA(Gly425)替换为GGC，使融合蛋白表达水平提高9.4%；(3) 通过消除凝血酶识别序列附近的Pro-Glu-Phe残基，提高凝血酶酶切效率，使rhADAM15产量提高了35.7%；(4)在GGA替换为GGC基础上切除“Pro-Glu-Phe”残基，使rhADAM15产量提高到68 mg/L，比分别切除“Pro-Glu-Phe”残基、GGA替换为GGC和野生型提高了19.2%、51.1%和61.9%。【结论】这一结果表明，在充分认识目标蛋白特性的基础上定向选择表达宿主并改造表达质粒能实现外源蛋白高水平表达。

关键词：ADAM15去整合素结构域；大肠杆菌Rosetta (DE3)；稀有密码子；PCR定点突变；抑制血管生成 中图分类号：Q816 文献标识码：A 文章编号：0001-6209 (2008) 08-1067-08

ADAM15是ADAM (A Disintegrin And Metallo-proteinase) 蛋白家族中唯一在其去整合素结构域中含有RGD序列(Arg-Gly-Asp)的成员，引起广泛的关注[1, 2]。Karkkainen等采用原位杂交证实编码ADAM15的基因位于人类染色体1q21.3，该基因所在区域在多种癌细胞中扩增[3]。研究发现，ADAM15在人类多种实体瘤细胞，如乳腺癌、直肠癌、胃癌、卵巢癌等肿瘤细胞中过量表达[4~7]。这些研究表明ADAM15与肿瘤生长转移密切相关，但其过量表达对肿瘤发展变化的影响机制尚不清楚。因此，获得大量具有生物活性的重组ADAM15或其片段蛋白(rhADAM15)对深入研究ADAM15在肿瘤发展变化中的作用机制，指导新型靶向抗肿瘤药物的研制具有

基金项目: 国家自然科学基金(30772586)

*

重要意义。

影响外源蛋白表达水平及其生物活性的因素在于目标蛋白自身编码基因、表达宿主以及诱导表达的营养与环境条件。为了获得大量具有生物活性的目标蛋白，长期以来研究人员在优化外源蛋白表达的生长温度、培养基组成、诱导物浓度及诱导最佳时机等方面做了大量工作，在一定程度上提高了目标蛋白的表达水平[8~10]。以ADAM15或其片段蛋白(rhADAM15)在大肠杆菌(Escherichia coli)和毕赤酵母(Pichia pas-toris)等宿主细胞中的表达为例[11，12]，尽管ADAM15蛋白在上述宿主中成功表达，但是其表达水平情况则未见报道，其原因可能在于对目标蛋白和表达宿主的特性及其之间关系缺乏充分认识。实际上对目标蛋白

通讯作者。Tel/Fax: +86-510-85918219; E-mail: jinjian31@hotmail.com

作者简介: 吴静(1981− ), 女, 江苏大丰人, 博士研究生, 主要从事细胞与分子药理的研究。E-mail: wujing@jiangnan.edu.cn 收稿日期: 2008-02-15; 修回日期: 2008-04-17

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和表达宿主的特性及相互关系认识的不足，使得表达宿主的选择具有较大的盲目性和偶然性，导致目标蛋白表达水平难以进一步提高。

本研究以ADAM15 去整合素结构域蛋白(rhADAM15)在大肠杆菌中表达为研究模型，采用目标蛋白cDNA序列分析选择最佳表达宿主和目标蛋白氨基酸序列分析构建高效表达质粒等策略相结合，改善稀有密码子和氨基酸残基所引起的目标蛋白表达限制，实现了目标蛋白rhADAM15高效表达。这一研究结果为获得大量具有生物活性的外源蛋白提供了切实可行的技术思路。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 质粒、菌株和细胞系：含有人ADAM15去整合素结构域编码基因的质粒pET-15b-ADAM15由中科院上海药物所陈勤博士惠赠；原核表达质粒pGEX-4T-1由江南大学李华钟教授惠赠；大肠杆菌XL-1 Blue、BL21 (DE3)、Rosetta (DE3)购自Novagen公司。人微血管内皮细胞(HMEC-1)由法国国家卫生医药研究院U553研究所(INSERM U553)陆核教授 馈赠。

1.1.2 主要试剂：基因定点突变试剂盒(TaKaRa MutanBEST)、Taq DNA聚合酶、T4DNA连接酶和各种限制性内切酶购于TaKaRa公司；

质粒抽提试剂盒、胶回收纯化试剂盒购于QIAGEN公司；Glutathione Sepharose 4B亲和层析柱购于Amersham-Pharmacia Biotech公司；蛋白定量试剂盒(Bicinchoninic acid, BCA)购于Pierce公司产品；低范围蛋白分子量Marker(4.1-66 kDa) 购于上海生工生物工程技术服务有限公司。

ADAM15羊多克隆抗体和辣根过氧化物酶(HRP)标记的驴抗羊二抗购于R&D公司，异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG)、5-溴-4-氯-3-吲哚- β -D-半乳糖苷(X-gal)、3-(4,5-二甲基-2-噻唑)-2,5-二苯基溴化四唑(MTT)、氨苄青霉素、氯霉素和MCDB131培养基均购自Sigma公司。

1.2 融合蛋白基因的克隆

1.2.1 PCR扩增目的基因：根据ADAM15 去整合素结构域编码基因(Met420-Glu510)[13]，利用引物设计软件oligo6.67，设计一对特异性引物P1和P2，上游引物为: 5′-GGCGTCGACTCATGGCTGCTTTCTGCGG-

AAATATG-3′

，下游引物为: 5′-ATACTCGCCATCCCCTAGGCTGAC-3′，为下一步表达需要，分别在上、下游引物中引入SalⅠ和NotⅠ酶切位点(斜体下划线)，并在SalⅠ酶切位点后添加TC碱基防止阅读框移位。PCR扩增条件：95℃ 3 min；95℃ 1 min，60℃ 1 min，72℃ 1 min，循环30次；72℃ 10 min。PCR产物进行1.5%琼脂糖电泳分析，并对目标条带切胶回收。

1.2.2 表达质粒pGEX-ADAM15的构建：PCR产物经胶回收纯化后与pUCm-T载体用T4DNA连接酶 16℃连接过夜，转化大肠杆菌XL-1-Blue感受态，涂布于含100 mg/L氨苄青霉素的LB平板上，菌落经蓝白斑筛选，抽提质粒用限制性内切酶SalⅠ和NotⅠ双酶切，回收目的片段与同样酶切的含GST-tag的pGEX-4T-1表达载体16℃连接反应过夜，产物转化大肠杆菌XL-1-Blue感受态细胞，涂布于含100 mg/L氨苄青霉素LB平板上，挑选菌落、质粒抽提，酶切鉴定筛选阳性单克隆，构建表达质粒命名为pGEX-ADAM15。

1.2.3 突变表达质粒pGEX-Δ1-ADAM15、pGEX-Δ2- ADAM15和pGEX-Δ-ADAM15的构建：①根据表达质粒pGEX-ADAM15的基因序列和突变引物设计原则[14]，设计一对方向相反的引物分别为P3：5′-CATACCCGGGAATCCACGCGGATCCGATTT-3′，P4：5′-GCTGCTTTCTGCGGCAATATGTTTGTC-3′，P4引入一个突变位点，即用GGC置换ADAM15第425位的编码甘氨酸的稀有密码子GGA。以表达质粒pGEX-ADAM15为模版，P3和P4为引物，采用基因

定点突变试剂盒的操作方法，通过PCR反应扩增含有突变位点的DNA片段，回收PCR产物后进行末端平滑及5′

磷酸化处理，再用高效连接试剂Ligation Solution I 进行自身连接(环化反应)，然后转化大肠杆菌XL-1-Blue感受态细胞，采用1.2.2中所述方法获得突变表达质粒pGEX-Δ1-ADAM15。②突变质粒pGEX-Δ2-ADAM15的构建方法与

pGEX-Δ1-

ADAM15类似，但是突变引物分别为：P5：5′-GGT- ATGGCTGCTTTCTGCGGAAAT-3′

，P6：5′-GGATC- CACGCGGAACCAG-3′

。突变质粒pGEX-Δ- ADAM15的构建则以pGEX-Δ2-ADAM15质粒为模板，P5和P6为突变引物，其余操作方法与构建pGEX-Δ1- ADAM15相同(质粒的构建示意图如图3所示)。所获得的4种质粒由上海生工生物技术有限公司测序。

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1.3 融合蛋白表达、纯化与鉴定

1.3.1 融合蛋白GST-ADAM15的诱导表达和纯化：将pGEX-ADAM15与pGEX-Δ-ADAM15质粒分别转化大肠杆菌Rosea(DE3)感受态得到稳定表达菌株Rosea (DE3)和ΔRosea (DE3)，具体诱导表达和纯化融合蛋白的方法见参考文献[15]，但是大肠杆菌Rosea(DE3)的培养基为LB培养液(含氨苄青霉素 50 mg/L，

氯霉素34 mg/L)。采用蛋白定量试剂盒(BCA)方法进行蛋白质定量，取部分样品进行SDS-PAGE分析。 1.3.2 融合蛋白GST-ADAM15的表达条件优化：为研究诱导条件(主要包括诱导剂IPTG的用量、诱导时菌体OD、诱导时间和诱导温度)对融合蛋白GST-ADAM15表达的影响，采用单因素实验研究不同IPTG用量(0.1、0.5和1 mmol/L)、IPTG添加时菌体OD值(0.4、0.8和1.2)、温度条件(培养温度为 37℃，诱导温度为37℃或30℃)、诱导维持时间(4、6和8 h)对融合蛋白GST-ADAM15表达的影响。 1.3.3 rhADAM15蛋白的纯化和鉴定：按10 U凝血酶/mg蛋白的用量将凝血酶加入已纯化的融合蛋白液体中，于4℃酶切8 h，取部分酶切产物进行SDS- PAGE分析。将酶切产物用截留分子质量3000的超滤装置浓缩蛋白质浓度至2 g/L左右，再用SephadexG-75凝胶过滤柱分离目标蛋白。采用BCA法对蛋白质含量进行测定。蛋白质的Western杂交分析按照标准流程进行[16]。

1.4 内皮小管形成分析

Matrigel基质胶在冰上融化，均匀包被预冷的96 孔板(70 μL/孔)，室温无菌条件下晾干，接种对数生长期密度为6×105 个/mL的HMEC-1细胞150 μL/孔，在37℃、

5%CO2 培养箱中培养60 min，加入rhADAM15样品，终浓度为20 μg/mL, 继续培养16 h时在显微镜下观察并照相。

1.5 rhADAM15对新生血管生成的作用

采用鸡胚尿囊膜法(CAM)测rhADAM15对新生血管生成的作用，具体方法见参加文献[17]。

2 结果

2.1 ADAM15去整合素结构域cDNA序列分析

将目的基因DNA片段插入载体pGEX-4T-1构建含有ADAM15 去整合素结构域的重组表达质粒pGEX-ADAM15并转化于表达宿主E. coli BL 21中，获得的融合蛋白GST-ADAM15的浓度为119 mg/L。进一步研究发现所表达的目标蛋白并不能破坏人微

血管内皮细胞(HMEC-1)形成内皮小管以及不抑制鸡胚尿囊膜新生血管的生成。那么，是什么原因导致目标蛋白表达水平偏低且无生物活性呢？

采用Morris Maduro开发的“E. coli Codon Usage Analysis 2.0”分析软件(.edu/~ maduro/codonusage/usage2.0c.htm)对人ADAM15 去整合素结构域cDNA序列进行详尽分析发现，人ADAM15去整合素结构域cDNA中含有14%的稀有密码子(甘氨酸密码子GGA、GGG，脯氨酸密码子CCC，亮氨酸密码子TTG、CTA，精氨酸密码子AGG、AGA)。这一结果表明，大量稀有密码子的存在导致重组蛋白表达的困难，必需选择能够为上述稀有密码子(AUA, AGG, AGA, CUA, CCC, GGA) 提供额外tRNA的菌株作为表达宿主，才有可能提高目标蛋白表达水平及生物活性。E. coli Rosetta(DE3)作为BL21的

突变株，能够为上述稀有密码子提供额外tRNA，将其作为rhADAM15的表达菌株可能提高蛋白的表达水平。 2.2 rhADAM15在E. coli Rosetta(DE3)中表达和条件优化

将质粒pGEX-ADAM15转化于表达宿主E. coli Rosetta (DE3)中，于37℃、0.5 mmol/L IPTG诱导6 h。收集菌体、破碎细胞后所得的上清液经

SDS-PAGE

图1 不同表达条件下融合蛋白GST-ADAM15 的SDS- PAGE电泳分析

Fig. 1 SDS–PAGE analysis on expression condition of fusion protein GST-ADAM15. (A) Effect of induction temperature and time. Lane 1-3, the temperature for culture and rhADAM15 expression was 37/37°C, 37/30°C, 30/30°C, respectively; Lane 4, Rosetta (DE3) with plasmid pGEX-4T-1; Lane 5-7, IPTG induc-tion time was 4, 6 and 8 h, respectively. (B) IPTG concentration and addition time. Lane1, Marker; Lane 2-3, Rosetta (DE3) without IPTG induction; Lane 4-6, Rosseta (DE3) induction by 0.1, 0.5 and 1 mM IPTG, respectively; Lane 7-9, IPTG induction when OD was 0.4, 0.8 and 1.2, respectively.

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分析发现，在大约37 kDa处有新蛋白质条带产生。由于GST分子量约为26 kDa，目标蛋白分子量约为11 kDa，这一结果表明融合蛋白GST-ADAM15在Rosetta (DE3)中得到表达。

采用单因实验对大肠杆菌生产融合蛋白GST- ADAM15的表达条件进行优化，结果显示(图1)，GST-

ADAM15最佳表达条件是：菌体浓度OD为0.8，IPTG浓度0.1 mmol/L，诱导温度30℃，诱导时间6 h。在最佳表达条件下，融合蛋白表达量占菌体总蛋白的66%，经Glutathione Sepharose 4B 亲和层析柱纯化后浓度为298 mg/L。 2.3 定点突变替换稀有密码子提高融合蛋白表达量

尽管Rosetta (DE3)能提供GGA，而不能提供

图2 融合蛋白GST-ADAM15结构示意图及相应表达质粒的部分测序图谱

Fig. 2 Map of the fusion protein GST-ADAM15 and parts of the DNA sequences of the corresponding plasmid. (A) Wide-type

GST-ADAM15 by cloning ADAM15 into pGEX-4T-1. (B) Engineered GST-Δ1-ADAM15 by optimizing rare GGA codon with GGC. (C) Engineered GST-Δ2-ADAM15 by deleting the amino acids residues of “Pro-Glu-Phe”. (D) Engineered GST-Δ-ADAM15 by optimizing

rare GGA codon with GGC and deleting the amino acids residues.of “Pro-Glu-Phe”.

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GGG和TTG密码子的tRNA。但若突变RGD序列中编码甘氨酸(第485位)的GGG会影响rhADAM15的特异性结构；另一方面，目的片段中TTG在E. coli稀有密码子中具有最高使用频率。因此，作者将目的 片段中数量大且使用频率低的GGA密码子突变为GGC (图2-B)，得到质粒pGEX-Δ1-ADAM15，转化E. coli Roseta (DE3)，最佳表达条件下融合蛋白GST-Δ1-ADAM15的表达量为菌体总蛋白的72%，浓度为326 mg/L，比未经定点突变的野生型融合蛋白GST-ADAM15的产量提高了9.4%。

2.4 改善凝血酶酶切效率提高rhADAM15产量

对于融合蛋白来说，凝血酶的酶切效率是影响目标蛋白产量的关键因素。在对融合蛋白GST- ADAM15结构域的分析时发现(图2-A)，凝血酶识别序列-3位Pro因其环状结构而减小了凝血酶识别的灵活性，而连接肽序列中Pro的存在会形成一个X-Pro连接，阻止了目标蛋白的折叠；同时，-2位的Glu为酸性氨基酸，也影响酶切效率。凝血酶属于丝氨酸蛋白酶，在精氨酸和赖氨酸残基后剪切，最优的酶切位点为P4-P3-Pro-Arg↓P1’-P2’(P4和P3为疏水性氨基酸，P1’和P2’为非酸性氨基酸)。

为提高凝血酶的酶切效率，增加目标蛋白的产量，将GST-ADAM15连接框中Pro-Glu-Phe氨基酸残基消除，构建了突变表达质粒pGEX-Δ2-ADAM15 (图2-C)；同样方法在pGEX-Δ1-ADAM15基础上构建得到突变表达质粒pGEX-Δ-ADAM15(图2-D)。将测序正确的突变质粒pGEX-Δ2-ADAM15和pGEX-Δ-ADAM15分别转化E. coli Roseta (DE3)并表达，在最佳表达条件下获得298 mg/L 融合蛋白GST-Δ2-ADAM15和326 mg/L GST-Δ-ADAM15(较GST-ADAM15提高了9.4%)。

将4种融合蛋白GST-ADAM15(野生型)、GST-

Δ1-ADAM15(稀有密码子替换)、GST-Δ2-ADAM15(消除氨基酸残基)和GST-Δ-ADAM15(稀有密码子替换和切除氨基酸残基)在相同条件下进行凝血酶消化，并经过SephadexG-75凝胶过滤柱纯化，分别得到42、51、57和68 mg/L的rhADAM15蛋白(纯度为95%)(图3-A)。其中，Pro-Glu-Phe氨基酸残基的消除使rhADAM15产量提高35.7%(表1)。这一结果表明， GST-ADAM15连接框中Pro-Glu-Phe氨基酸残基的消除能显著提高凝血酶的酶切效率，从而提高rhADAM15的产量。

2.5 rhADAM15的Western blot杂交鉴定

将从上述4种融合蛋白中纯化获得的rhADAM15蛋白分别用抗ADAM15多克隆抗体进行蛋白质杂交鉴定。结果显示，rhADAM15在11 kDa附近显示单一条带，与目标蛋白分子质量一致(图3-B)。而且，4种蛋白经氨基酸序列表明所含氨基酸残基完全相同。因此，初步判定这四种蛋白均为重组人ADAM15 去整合素结构域的重组蛋白片段。

图3 4种rhADAM15蛋白的Tricine-SDS-PAGE分析(A)及对应Western blot杂交鉴定(B)

Fig. 3 Tricine-SDS-PAGE and Western blot analysis of purified rhADAM15. A: Tricine-SDS-PAGE analysis. Lane 1-4, the purified rhADAM15 from the fusion protein GST-ADAM15, GST-Δ1- ADAM15, GST-Δ2-ADAM15 and GST-Δ-ADAM15, respectively. B:Western blot analysis. Lane 5-8, blots of rhADAM15 from the fusion protein GST-ADAM15, GST-Δ1-ADAM15, GST-Δ2- ADAM15 and GST-Δ-ADAM15, respectively.

表1 不同方法构建表达质粒时的蛋白表达情况比较

Table 1 Comparison of the results with different strategies

Strains Plasmid GST-ADAM15/(mg/L) a rhADAM15/(mg/L)

E. coli BL21

E. coli Roseta (DE3)

E. coli Roseta (DE3)

(With GGA changed to GGC) E. coli Roseta (DE3)

(With “Pro-Glu-Phe” deleting) E. coli Roseta (DE3)

(With GGA changed to GGC and “Pro-Glu-Phe” deleting)

a

pGEX-ADAM15 119 18 pGEX-ADAM15 298 (0%) b 42 (0%) pGEX-Δ1-ADAM15 pGEX-Δ2-ADAM15 pGEX-Δ-ADAM15

326 (9.4%) 298 (0%) 326 (9.4%)

45 (7.1%) 57 (35.7%) 68 (61.9%)

The protein concentration was determined by BCA Assay. b The increase percent when compared with that of rhADAM15 expressed in E. coli

Roseta (DE3).

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2.6 rhADAM15的生物活性分析

将4种方法获得的rhADAM15蛋白分别作用于内皮细胞(HMEC-1)，观察蛋白作用对内皮小管形成的影响。实验结果表明(图4)，4种蛋白在剂量为20 μg/mL，作用时间为16 h时，均可抑制HMEC-1内皮小管的形成，但来源于GST-Δ-ADAM15的rhADAM15可完全破环内皮小管形成；源于GST-Δ2-ADAM15的rhADAM15部分破环内皮小管形成；源于GST- ADAM15和GST-Δ1-ADAM15的rhADAM15抑制作用相似，较前两

者有所减弱。同时，采用鸡胚尿囊膜法(CAM) 检测来源于GST-Δ-ADAM15的rhADAM15对新生血管生成的作用，结果表明(图5)，rhADAM15在剂量为20 μg/egg时，能明显抑制鸡胚尿囊膜新生血管的生成，并呈现剂量依赖性。这一结果表明，通过选择能提供稀有密码子的表达宿主E. coli Rosetta (DE3)可以获得具有生物活性的rhADAM15蛋白，并且在优化稀有密码子及提高凝血酶酶切效率获得高产量的rhADAM15蛋白时，该蛋白也表现出较高的生物活性。

图4 4种rhADAM15蛋白对内皮小管形成的作用

Fig. 4 Effect of rhADAM15 on HMEC-1 tube formation. The four different rhADAM15 at the concentration of 20 ug/mL were incu-bated with HMEC-1 for 16 h, respectively. A was the control, B, C, D and E are respect to the rhADAM15 from the fusion protein

GST-ADAM15, GST-Δ1-ADAM15, GST-Δ2-ADAM15 and GST-Δ-ADAM15, respectively.

图5 rhADAM15蛋白对鸡胚尿囊膜新生血管的形成的作用

Fig. 5 Effect of rhADAM15 on CAM. CAM were treated with rhADAM15 for 60 h, harvested and photographed.

(A) rhADAM15, 0 μg/egg; (B) rhADAM15, 20 μg/egg; (C) rhADAM15, 40 μg/egg.

3 讨论

在本研究中发现，ADAM15去整合素结构域蛋白表达于E. coli BL21时尽管获得了一定量的rhADAM15，但没有生物活性。对ADAM15 去整合其结构域中含有14%素结构域的cDNA分析时发现，

的稀有密码子(甘氨酸密码子GGA、GGG，脯氨酸密码子CCC，亮氨酸密码子TTG、CTA，精氨酸密码子AGG、AGA)。这些稀有密码子的存在可能是导致rhADAM15在宿主菌E. coli BL21 (DE3)中表达水平

有限和生物活性缺失的主要原因。类似地，Jeon OH等尽管在毕赤酵母中获得了具有生物活性的ADAM15去整合素结构域蛋白，但却难以在大肠杆菌中表达[11]。Zhang和Trochon等在在宿主菌E. coli DH5α中以GST融合蛋白的形式表达了ADAM15去整合素结构域蛋白并发现其可以与整合素αvβ3相互作用，并具有抑制肿瘤细胞的生长、转移和血管形成等重要功能，但没有报道该蛋白的表达产量情况[12,18]。最近，Lu等同样在E. coli DH5α中获得了ADAM15 去整合素结构域蛋白，并进一步发现其具有抑制气管平滑肌细胞的

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迁移和粘附功能，但仍然没有涉及该蛋白的表达产量[19]。

本研究在对目标蛋白ADAM15 去整合素结构域的cDNA及其与GST融合蛋白序列进行分析的基础上，采用定向选择高效表达宿主、定点突变替换稀有密码子和改造酶切位点等策略，提供rhADAM15高效表达所需的稀有密码子和高效酶切位点，实现了rhADAM15大量积累。表1详细列出了不同策略对融合蛋白表达水平和rhADAM15产量的影响：(1)当选用E. coli BL21作为宿主菌时，尽管有119 mg/L融合蛋白GST-ADAM15表达，但rhADAM15没有生物活性；(2)基于稀有密码子分析定向选择能改善由于稀有密码子造成表达限制的Roseta (DE3)作为表达宿主，融合蛋白GST-ADAM15表达水平提高到298 mg/L，比E. coli BL21为宿主菌时提高了150%，rhADAM15产量提高了130%，且表现出较高的生物活性；(3)将ADAM15 去整合素结构域中甘氨酸稀有密码子GGA替换为GGC，融合蛋白的表达量提高到了326 mg/L，提高了9.4%，但不能提高rhADAM15产量；(4)仅消除GST-ADAM15表达框中“Pro-Glu-Phe”残基，并不能有效地提高融合蛋白的表达量，但能使rhADAM15产量提高35.7%(与野生型比较)。如同时切除“Pro-Glu-Phe”残基和GGA替换为GGC，则使rhADAM15产量提高到68 mg/L，比分别切除“Pro-Glu-Phe”残基、GGA替换为GGC和野生型提高了19.2%、51.1%和61.9%。类似地， 在E. coli BL21 (DE3)和Rosetta (DE3)中分别表达含有稀有密码子的人类肿瘤抑制因子LKB1，发现从Rosetta (DE3)中获得的重组蛋白无论表达量还是对肝癌细胞生长的抑制率明显高于BL21 (DE3)

[20]

；同时与E. coli BL21 (DE3)

相比，在Rosetta (DE3)中表达含有稀有密码子的5-氨基酮戊酸合成酶(ALA)，也获得了较高的产量[9]

；消除重组人α干扰素(rhIFNα)凝血酶识别位点附近的“Pro-Glu- Phe”残基使得rhIFNα产量达到100 mg/L

[10]

。

采用不同方法制备的rhADAM15均能与抗ADAM15抗体发生特异性反应，并破坏内皮细胞在Matrigel基质胶上形成内皮小管(图4)，其中，联合采用密码子优化和“Pro-Glu-Phe”氨基酸残基消除的方法获得的rhADAM15蛋白表现出明显地破环作用。而且，该方法获得的rhADAM15蛋白可明显抑制鸡胚尿囊膜新生血管的生成，表明其具有潜在的抑制肿瘤新生血管形成的作用。因此，本研究所提出的研究策略为进一步提高重组蛋白的表达量提供了新的途

径；另一方面，所获得的高产量rhADAM15为深入研究ADAM15抗肿瘤机理奠定了坚实的物质基础，也为ADAM15或其片段蛋白在癌症治疗中的应用提供参考。

参 考 文 献

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Improving production and bioactivity of recombinant human disintegrin

domain of ADAM15 (rhADAM15) in Escherichia Coli

Jing Wu1,2, Jianyong Lei1, Lianfen Zhang1,2, Hui Hua1, Jian Jin1,2*

(1Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education, 2Department of Pharmaceutical and Molecular Biotechnology,

School of Pharmaceutical and medical, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

Abstract: [Objective] To enhance the production and bioactivity of recombinant human disintegrin domain of ADAM15 (A Disintegrin and Metalloproteinase 15) (rhADAM15) in Escherichia coli. [Methods] The expression host was chose and the recombinant expression plasmid pGEX-ADAM15 was constructed, based on analysis of the cDNA sequence of rhA-DAM15. [Results] (1) 298 mg/L GST (Glutathione-S-transferase)-ADAM15 and 42 mg/L rhADAM15 were achieved when choosing E. coli Rosetta (DE3) as the expression host that could supply additional tRNA for rare codons. (2) The GST-ADAM15 expression level increased to 326 mg/L after changing the rare codon GGA (Gly425) to GGC by PCR (Po-lymerase Chain Reaction)-based site-directed mutagenesis. (3) The rhADAM15 concentration increased to 57 mg/L by deleting the “Pro-Glu-Phe” at the GST-ADAM15 junction to improve the thrombin cleavage efficiency. (4) Finally, by combinational introduction of the favorable codons and suitably eliminating of certain amino acid sequence, rhADAM15 concentration reached the highest level (68 mg/L). [Conclusion] The high expression of heterologous protein could be achieved by releasing rare codon usage and amino acids residues restriction.

Keywords: recombinant ADAM15 disintegrin domain; Escherichia coli Rosetta (DE3); rare codons; PCR site-directed mutagenesis; anti-angiogenesis

Supported by a grant from The National Natural Science Foundation of China (30772586) *

Corresponding author. Tel/Fax: +86-510-85918219 E-mail: jinjian31@hotmail.com Received: 15 Fepuary 2008/ Revised: 17 April 2008