血红蛋白的提取和分离重难点解析 血红蛋白分离提取流程
文件编号：1003―7586(2010)04―0059―02 血红蛋白的提取和分离一般步骤为样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。
1 样品处理
1.1 红细胞的洗涤
洗涤红细胞的目的是去除杂蛋白，采集的血样要及时采用低速短时间离心分离红细胞，然后用胶头吸管吸出上层透明的黄色血浆，将下层暗红色的红细胞液体倒入烧杯，再加入五倍体积的生理盐水，缓慢搅拌10min，低速短时间离心，如此重复洗涤3次，直至上清液中没有黄色，表明红细胞已洗涤干净。
1.2 血红蛋白的释放
在蒸馏水和甲苯作用下，红细胞破裂释放出血红蛋白，加入蒸馏水后红细胞液体积与原血液体积要相同。加入甲苯的目的是溶解细胞膜，有利于血红蛋白的释放和分离。
2 粗分离
2.1 分离血红蛋白溶液
将搅拌好的混合溶液离心后，试管中的溶液分为4层。第1层为无色透明的甲苯层，第2层为白色薄层固体，是脂溶性物质的沉淀层，第3层是红色透明液体，这是血红蛋白的水溶液，第4层是其他杂质的暗红色沉淀物。将试管中的液体用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体。
2.2 透析
取1mL的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有300mL的物质的量浓度为20mmol／L的磷酸缓冲液中，透析12h。透析可以去除样品中分子量较小的杂质。
3 纯化
利用凝胶色谱柱可对血红蛋白进行纯化(图1)。
4 纯度鉴定
使用最多的是SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。
5 血红蛋白的提取和分离操作问题分析
5.1 血红蛋白的提取
红细胞分层不明显，可能是洗涤次数少，未能除去血浆蛋白的原因。此外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。
5.2 检测凝胶色谱柱的装填是否成功的方法
由于凝胶是一种半透明的介质，因此可以在凝胶柱旁放一支与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝胶是否装填得均匀。此外，还可以加入大分子的有色物质，观察色带移动的情况。如果色带均匀、狭窄、平整，说明凝胶色谱柱的性能良好。如果色谱柱出现纹路或是气泡，轻轻敲打柱体以消除气泡，消除不了时要重新装柱。
5.3 凝胶的装填标准：紧密、均匀
如果凝胶装填得不够紧密、均匀，就会在色谱柱内形成无数的空隙，使本该进入凝胶内部的样品分子从这些空隙中通过，扰乱洗脱液的流动次序，影响分离的效果。
5.4 沸水浴处理加入洗脱液的湿凝胶的目的
这样操作不但节约时间，还能除去凝胶中可能带有的微生物，排除凝胶内的空气。
5.5 G--75
“G”代表凝胶的交联程度、膨胀程度及分离范围，75表示凝胶得水值，即每克凝胶膨胀时吸水7.5g。
5.6 装填完后，立即用洗脱液洗脱的目的
此操作的目的是使凝胶装填紧密。
5.7 实验过程加入柠檬酸钠
加入柠檬酸钠的目的是防止血液凝固；低速、短时离心防止白细胞沉淀；缓慢搅拌防止红细胞破裂释放出血红蛋白。
5.8 检测血红蛋白的分离是否成功的方法
如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确的话，能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随着洗脱液缓慢流出；如果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分离的效果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关。
6 典型例题
【例1】在血红蛋白的提取和分离实验中，下列操作正确的是( )
A 分离红细胞时需去除上层透明的黄色血浆
B 红细胞释放出血红蛋白时只需加入蒸馏水
C 分离血红蛋白溶液是低速短时间离心
D 洗脱时，待红色蛋白质下移即开始收集流出液
思维启导：红细胞释放出血红蛋白除需加入蒸馏水，还需加入40％体积的甲苯；分离血红蛋白溶液是高速长时间离心；洗脱时，待红色蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每5 mL收集一管，连续收集。
参考答案：A。
【例2】下列有关提取和分离血红蛋白的程序，叙述错误的是( )
A 样品的处理就是通过一系列操作收集到血红蛋白溶液
B 通过透析可能去除样品中相对分子质量较大的杂质，此为样品的粗提取
C 可通过凝胶色谱法将相对分子质量大的杂质蛋白除去，即样品的纯化
D 可通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定血红蛋白的纯度
思维启导：首先通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离心等操作收集到血红蛋白溶液，即样品的处理；再经过透析去除相对分子质量较小的杂质，即样品的粗分离；然后通过凝胶色谱法将相对分子质量大的杂质蛋白除去，即样品的纯化；最后经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定，由此可知B的叙述错误。由玻璃纸制成的透析袋能使小分子自由进出，而将大分子保留在袋内，透析可以去除样品中相对分子质量较小的杂质。
参考答案：B。
【例3】红细胞含有大量的血红蛋白，红细胞的机能主要是由血红蛋白完成，血红蛋白的主要功能是携带氧气或二氧化碳，我们可以选用猪、牛、羊或其他脊椎动物的血液进行实验，来提取和分离血红蛋白，请回答下列有关问题：
(1)实验前取新鲜的血液，要切记在采血容器中预先加入柠檬酸钠，取血回来，马上进行离心，收集血红蛋白溶液。
①加入柠檬酸钠的目的是___________。
②以上所述的过程即是样品处理，它包括__________、_________、收集血红蛋白溶液。
(2)收集的血红蛋白溶液在透析袋中可以经过透析，这就是样品的粗分离。
①透析的目的是
②透析的原理是
(3)然后通过凝胶色谱法将样品进一步纯化，最后经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定。
①样品纯化的目的是__________。
②血红蛋白有什么特点?
这一特点对进行蛋白质的分离有什么意义?
思维启导：柠檬酸钠是一种抗凝剂，能够防止血液凝固。凝胶色谱柱中如果产生了气泡，气泡就会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。
参考答案：
(1)①防止血液凝固
②红细胞的洗涤血红蛋白的释放
(2)①去除分子质量较小的杂质
②透析袋能使小分子自由进出，而大分子则保留在袋内
(3)①通过凝胶色谱法将相对分子质量大的杂质蛋白除去
②血红蛋白呈现红色，在凝胶色谱分离时，可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液
使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作