孢子形态 黄瓜花器形态发生_小孢子发育与花药培养_谢淼

西北植物学报, 2005, 25(6) :1096—1100Acta Bot . Boreal . -Occident . Sin .

文章编号:1000-4025(2005) 06-1096-05

黄瓜花器形态发生、小孢子发育与花药培养

谢　淼, 秦丽颖, 潘俊松, 何欢乐, 吴爱忠, 蔡　润

(上海交通大学农业与生物学院, 上海201101)

*

摘　要:孢子发育时期与花蕾形态特征、花药颜色具有相关性. 本试验目的是确定黄瓜花药的最佳培养时期, 并确定对应的选蕾标准. 对基因型、预处理等花药培养主要影响因素研究结果表明:不同基因型小孢子单核中后期花蕾长度不同, 形态上没有差异; 同一基因型的小孢子发育不同时期的花器特征和诱导率均有差异, 单核中后期花药诱导率最高; 低温预处理有利于保持小孢子的活力; 花药培养中以黑暗中4℃、48～72h 低温预处理最有助于愈伤发生. 实验结果表明, 黄瓜花药培养中小孢子最佳培养时期为单核中后期, 取蕾标准为:花蕾长度0. 90～1. 50cm , 绿色, 瓣尖未张开, 花药白绿色或淡绿色. 关键词:黄瓜; 小孢子; 发育时期; 花药培养

中图分类号:Q 944. 58; Q 949. 782　　　文献标识码:A

Flower Morphogenesis and Microspore Development

Versus Anther Culture of Cucumber

*

XIE Miao , Q IN Li -y ing , PAN Jun -song , HE Huan -le , WU Ai -zhong , CAI Run

(Shanghai Jiaotong University, Agricu lture and Biology S chool, S hanghai 201101, Ch ina)

Abstract :M icr ospore dev elo pm ent sho wed co rrelativity w ith the m orphological characteristics o f buds , and the color of anthers . The ex periment w as intended to determine the stag e of anther development at w hich anthers could be optimally cultured, and the co rresponding standards that co uld be adopted to select buds. The major factors affecting anther culture such as genotypes and pretr eatment w ere studied, shich indicated that the buds differed in leng th w ith differ ent geno ty pes at middle to later mo no kary on stages of mi-cro spore development but did not differed in morpholog y w ith different g enotypes; flow er characteristies and anther inductiv ities o f same genotypes differed at different stage of microspore dev elo pment and the hig hest anther inductivity appear ed at middle to late mo nokary on stag es . T he pr etreatm ent with low tem-peratur e w as beneficial to maintaining microspor e vitality . For anther culture , the pretreatment in dark w ith low temper ature at 4℃for 48～72h w as the m ost conducive to callus occurrence. The ex perim ental results demo nstr ated that in the culture of cucumber anthers, the micro spores could be optimally cultured at the middle to late mo no kary on stages of microspore development and the bud -selecting standards w ere that the buds w ere 0. 90～1. 5cm long and green, the cro w ns w er e not open in their top ends, and the anthers were w hite g reen o r lig ht green.

Key words :cucumber ; m icrospo re; development stage; anther culture

收稿日期:2004-10-29; 修改稿收到日期:2005-03-01

基金项目:上海市农委招标项目资助(农科攻字2001-3-10)

作者简介:谢　淼(1979-) , 女, 江苏人, 在读硕士研究生, 主要从事植物遗传育种的工作. *通讯联系人. C or res pon dence to:CAI Run. cairun @s jtu. ed u. cn

6期谢　淼, 等:黄瓜花器形态发生、小孢子发育与花药培养

　　迄今为止, 花药培养的成功主要局限在3个科的植物, 即茄科、禾本科、十字花科. 在葫芦科植物中, 主要研究内容集中于一些瓜类植物的小孢子雄核发育过程和小孢子发生期间花药壁的变化. 黄瓜花药培养的研究报道较少, 原因是目前黄瓜花药培养还未建立较成熟的植株再生体系. 根据现今研究资料, 产生单倍体的效率取决于多个因素, 而取花药时的小孢子发育时期是其中一个关键的因素, 关系到是否能产生胚性愈伤组织, 进而产生单倍体. 本试验通过细胞学与花药形态观察, 确定黄瓜花药小孢子不同发育时期花器的形态特征; 并对花药培养中最主要的影响因素, 如基因型、激素和预处理等进行分析, 确定黄瓜花药培养的适宜培养条件, 选择出最适合黄瓜花培的小孢子时期以及对应的花器形态特点, 以期为育种工作提供理论与技术基础.

[1]

[1]

蔗糖50g ・L +琼脂5. 2g ・L ; (II) B5+2, 4-D 0. 442m g ・L -1+BA 0. 225mg ・L -1+蔗糖50g ・L -1+琼脂5. 2g ・L -1, pH 值均为5. 8.

-1-1

2　结果与分析

2. 1　小孢子发育时期与花蕾外部形态的关系

用小孢子处于不同发育时期的花药进行培养, 愈伤组织的诱导频率有所不同. 不同材料的小孢子各时期的花蕾大小不同, 因此接种前对实验材料进行发育时期的检测十分必要. 结果表明(图1, A ) , 宝杂二号花蕾的长度随花粉粒的发育一直在增加. 花药颜色变化分别为:翠绿色→绿色→淡绿色→白绿色→黄白色.

四分体时期的花蕾长度在0. 35～0. 50cm 之间, 萼片包裹紧密, 花萼深绿色, 长大于花冠, 外披一层绿色绒毛, 花冠不展开, 花药体积小, 翠绿色, 显微镜下观察到四分孢子(图1, B). 单核早期时, 花蕾长度0. 50～0. 90cm 之间, 花萼绿色, 花冠淡绿色, 紧闭未张开. 花药呈绿色, 显微镜下发现细胞核位于中央(图1, C). 单核中晚期, 花蕾长度为0. 90～1. 50cm , 花萼绿色, 整体仍闭合, 花冠瓣尖没有张开, 花药呈浅绿色, 显微镜下观察到单核靠近细胞壁(图1, D ) . 双核期, 花蕾长度1. 50～1. 80cm , 花萼呈淡绿色, 花冠黄绿色, 花冠瓣尖部分张开, 花药呈白绿色, 显微镜下观察到营养核和生殖核(图1, E) . 成熟花粉粒时期(图1, F) , 花蕾明显增大, 长度达到1. 80cm 以上, 花蕾明显增长, 花萼黄绿色, 瓣尖已张开, 并且颜色呈黄绿色或黄色, 此时花药黄白色, 甚至有些花药可以看见花粉散出附着于药壁上. 用冰冻切片法对成熟花粉粒时期和单核期的花药切片, 可以看到, 成熟花粉粒时期的药室破裂, 药室内小孢子明显可见, 而单核期花药药室结构较完整. (图1, G 、H ).

2. 2　小孢子单核中后期与花蕾外部形态特征的对应关系

　　选用6种不同基因型研究小孢子单核中后期与花蕾外部形态特征的关系. 结果(表1) 表明, 不同基因型处于单核中后期的小孢子, 其花蕾长度、颜色没有差异, 都为绿色; 花药颜色稍有区别, 大部分材料颜色是白绿色, 此时花瓣尖还未张开. S52、BC-3的花蕾要比其它材料长, 但花药纵径×横径大小不及

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1　材料和方法

1. 1　材　料

供试黄瓜材料由上海交通大学农业与生物学院作物遗传育种实验室提供, 分别为宝杂二号(华南型) 、S 52(华南型) 、S 0652(华南型) 、BC -11(华北型×欧洲型) 、S104(华南型) 1. 2　方　法

1. 2. 1　小孢子发育时期的检测　将黄瓜花蕾按长度(单位cm) 分级:0. 35～0. 50, 0. 50～0. 90, 0. 90～1. 50, 1. 50～1. 80, >1. 80. 观察相应花蕾特征和花药颜色, 并用醋酸洋红染色制片观察花粉.

1. 2. 2　花药消毒与接种　将花蕾置于黑暗条件下低温(4℃) 预处理不同天数或不进行预处理. 用75%酒精浸泡30s, 饱和漂白精溶液(加入2～3滴Tw een 20) 处理20min , 再用无菌水冲洗3～4次. 无菌条件下, 剥取花药接种于诱导培养基上, 诱导愈伤组织.

1. 2. 3　花药冰冻切片　取新鲜的花药进行冰冻切片, 切片厚度为18 m. 观察花药内部形态结构与外部形态结构的对应关系.

1. 2. 4　培养条件　花药接种后, 先暗培养1～2周, 温度(25±2) ℃, 然后进行光照培养, 光照12h ・

-1

d , 光强2000lx .

1. 2. 5　培养基　诱导培养基为(I ) MS +2, 4-D 1. 0mg ・L

-1

+BA 1. 0mg ・L -1+IAA 0. 5・L -1+

西　北　植　物　学　报25卷

其它基因型.

表1　不同品种小孢子单核中后期与花蕾形态特征的关系

T able 1　Bud mo rpholog ies of differ ent var ieties a t middle to late m onokar yo n sta ge

基因型Gen otypes 宝杂二号Baoza 2BC -3S 52BC-11S104S0652

花蕾长Bud length(cm ) 0. 90-1. 501. 00-1. 551. 00-1. 600. 90-1. 451. 00-1. 501. 00-1. 45

花药纵径×横径

Anther len gth w ays dia. ×trans vers e dia.

(cm ×cm)

0. 25×0. 400. 20×0. 300. 20×0. 350. 23×0. 400. 24×0. 420. 25×0. 35

花蕾颜色Bud color 绿色绿色绿色绿色绿色绿色

花药颜色Anther color 淡绿色白绿色白绿色淡绿色淡绿色白绿色

图1　小孢子不同发育时期的花蕾外部形态

A . 花蕾与花药形态(从右到左:a . 四分体时期, b . 单核早期　c . 单核中后期　d . 双核期　e . 成熟花粉粒时期) ; B . 四分体时期(显微镜下观察到四分孢子) ; C . 单核早期; D . 单核中晚期; E . 双核期; F . 成熟花粉粒时期; G . 花药冰冻切片(成熟花粉粒时期:外层花药壁解体) ; H . 花药冰冻切片(单核期:药室结构比较完整)

Fig. 1　Ex ter na l mo rpholog y o f flow er buds at differ ent dev elo pment st ages of m icro spo res

A. Bud and anther morpholog ies (fr om right to left:a. T etrad s tage 　b. Early monokaryon s tage 　c. M idd le to late monokaryon s tage 　d. Binu-cleate s tage 　e . M ature -micros pore stage ) ; B . T etrads stage (tetraspores seen w ith a micros cope ) ; C . Early monok aryon stage ; D . M iddle to late monokaryon s tage; E. Binucleate s tage; F. M ature-microspore s tage; G. Frozen section of the anthers (w ith outer an th er w all dis integr ated at mature-m icrospore stage) ; H. Frozen s ection of the anthers(w ith the pollen grain chambers relatively in tact.

6期谢　淼, 等:黄瓜花器形态发生、小孢子发育与花药培养

2. 3　小孢子不同发育时期对花药培养的影响

取不同长度的花药进行愈伤组织诱导培养, 结果(表2) 表明, 当宝杂二号的花蕾长度大于1. 8cm 时, 花药不能诱导出愈伤组织. 绝大部分长0. 90～1. 50cm 花蕾的花药接种后开始变色, 颜色转为黄绿色, 并从药壁内侧逐渐长出绿色的愈伤组织; 另有小部分花药变成褐色, 死亡. 长0. 90～1. 50cm 花蕾的花药最容易诱导产生愈伤组织, 诱导率为77. 4%, 此时对应的小孢子大多数处于单核中后期, 因此认为单核中后期的花药作为外植体较适宜.

表2　宝杂二号小孢子不同发育时期对花药培养的影响T able 2　Callus inductiv ities at differ ent stag es o f micr ospo r e

development in the anther cult ur e of Bao za 2

花蕾长Bud leng th (cm ) 0. 35-0. 500. 50-0. 900. 90-1. 500. 50-1. 80>1. 80

花药数(个) Anther num ber

[1**********]050

愈伤组织诱导率Callus induct i v ity

(%) 22. 873. 977. 433. 20

2. 6　接种季节对花药培养的影响

分别于春秋两季接种黄瓜花药(宝杂二号, S 52) 于培养基II 中进行诱导培养, 结果如图2. 宝杂二号在春季接种的诱导率为77. 35%, S52春季诱导率最高达82. 15%.而同一品种S52在秋季接种的花药诱导率只有32. 17%.认为在接种材料发育时期一致的情况下, 由于接种季节不同而引起的诱导率的差异在很大程度上取决于当时外界光照和温度等条件. 所以不同接种季节诱导率不同, 但总体上早春4月接种的花药要比秋季10月的花药诱导率要高.

2. 4　基因型对花药培养的影响

选取宝杂二号、S 52、S 0652、BC -3、S 104单核中后期黄瓜花药进行B5诱导愈伤组织培养. 结果都可以诱导出愈伤组织, 花药愈伤组织诱导率从高到低依次为:S 52、宝杂二号、S 104、S 0652、BC -3, 其中S 52和宝杂二号诱导率分别为82. 15%和77. 35%, 较易诱导出愈伤组织, 而且愈伤组织为黄绿色, 数量多. S104为60. 00%, 为黄色愈伤块, S0652为24. 00%, BC -3为16. 67%, 都为黄褐色愈伤块. 说明在相同培养条件下, 不同基因型的黄瓜花药培养存在一定差异, 基因型是影响花药培养的重要因素. 2. 5　预处理对花药培养的影响

经低温(4℃) 预处理48、72、120、168h 后, 用小孢子处于单核中后期的花药进行培养, 都能诱导出愈伤组织. 经过低温预处理24h 和未经任何处理的花药获得的愈伤组织诱导率差异不大, 分别为20. 15%和18. 67%.但是随预处理时间延长, 其诱导率逐渐提高. 48、72h 低温预处理对宝杂二号花药培养效果较好, 诱导率分别为75. 31%、77. 35%.但是当处理时间增加到120h 以上时, 花蕾会发生不同程度的变软, 消毒后花药变白, 死亡; 处理120h 出愈率为3. 2%, 168h 为1. 36%.室温处理24h 后的花药接种到培养基后, 诱导率为0, 花药在培养基上逐渐变褐, 甚至接种后有些花药直接发白死亡.

试验说明, 小孢子处于单核中后期的花药为较

适宜的低温预处理条件是:4℃, 48～72h .

图2　不同接种日期对诱导愈伤组织的影响Fig . 2　Callus inductio ns on different innoculating dates

3　讨　论

3. 1　关于小孢子发育时期与花蕾大小的相关性小孢子细胞发育时期一般分为四分体时期、小孢子时期(单核早期、单核中期、单核靠边期、双核

[2, 3]

期) 和成熟花粉粒时期. 不同植物花药培养最适宜的小孢子发育时期不同, 一般所处发育期越早的花粉, 对培养条件的要求越苛刻, 且培养效果不一定好[5]. 有文献指出甜瓜花药培养最佳时期是单核靠边期到双核期, No vak 等通过实验指出辣椒的最适时期是单核期, 王玉英在此基础上得出单核靠边期为最好时期. 本试验发现, 花蕾长度在0. 90～1. 50cm , 小孢子大部分处于单核中后期的花药诱导率最高, 说明此种状态下的小孢子能最有效地被诱导; 花蕾长度在0. 5～0. 9cm 时, 大部分小孢子对应时期是单核早期, 诱导率次之, 在花药培养中也可以利用该时期的花药. 双核期的小孢子诱导率为较低, 四分体时期和成熟花粉粒时期的花药诱导率很低, 花药培养在田间选择花蕾时可以不用考虑. 所以花药培养时应选择小孢子单核期, 但是考虑到花药培养时需要预处理等因素, 推荐采用小孢子处于单核中后期的花药.

3. 2　基因型对花药培养的影响

花药对离体培养的反应在很大程度上受到基因

[7]

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型的影响. Gresshoff(1972) 提出, 不同品系对愈

[9]

伤组织的产生有着重要影响. Irikura(1975) 报道, 在属于茄属的46个物种和9个种间杂种中, 只有19个物种和4个杂种能产生花粉植株. 基因型不同, 花药的胚状体诱导率不同. 试验结果表明, 基因型不同, 诱导率也不同. 宝杂二号和S 52是比较容易诱导出愈伤组织的基因型.

3. 3　低温预处理对花药培养的影响

花药在离体培养前一般要进行预处理, 包括:低温预处理、低温后处理以及热激(heat shock ) 处理. 在多数物种的花药培养中, 上述几种变温处理都可以在不同程度上提高花粉愈伤组织或花粉胚状体的诱导. 目前花培研究中, 以低温预处理应用最广泛.

低温预处理的作用主要是能够提供一个合适的环境以利于花粉的诱导及其在诱导期存活. 如果从植株上取下花药直接接种, 愈伤组织和胚状体的发生率都很低. 为了提高其出胚的敏感性, 一般要进行

[4]

[10][8]

预处理, 实验结果也说明这一点.

4℃低温下分别预处理48、72、120、168h 以及室温下预处理0h 几种方案的研究表明, 4℃, 72h 的预处理方式是最佳的预处理条件. 并且发现低温预处理时间越长或不进行预处理都不能有效地提高花药诱导率.

3. 4　接种季节对花药培养的影响

本次试验中, 虽然每次接种材料前都挑选单核中后期的花药进行接种, 但不同接种季节诱导出的愈伤组织诱导率存在差异. 生长在较低温度下的植株, 其花药具有较高的花粉愈伤和胚胎发生能力, 袁

[10]

亦楠等在番茄小孢子培养中发现薯叶番茄10月份与5月下旬花蕾的类胚发生频率分别为0. 25%和0. 01%.本实验认为产生这种差异的实质是生长环境条件(如:光照、温度、湿度等) 不同. 春秋两季的诱导率在排除污染率不同而产生的差异之外, 4月份接种的花药诱导率要高于10月份. 总的来说, 春节接种的材料诱导率高于秋季的材料.

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