人端粒酶催化亚单位启动子调控自杀基因ＨＳＶ－ＴＫ肿瘤细胞特异性表达载体的构建

　　摘　要：将自杀基因TK插入质粒pGL3-hTp和pGL3-Control中，取代其上的荧光素酶基因，分别构建hTERT启动子和SV40启动子调控的TK基因表达质粒pGL3-hTp-hK和pGL3-SV40-TK，酶切和PCR鉴定结果显示重组质粒pCL3-hTp-TK和pGL3-Sv40-TK构建成功；用脂质体法将pGL3-hTp-TK和pGL3-SV40-TK瞬时转染端粒酶阳性的人肺腺癌细胞株A549及端粒酶阴性的人胚肺成纤�细胞株MRC-5，RT-PCR显示转染pCL3-SV40-TK的细胞A549和MRC-5均有TK mRNA表达，转染pcL3-hTp-TK的A549细胞中也有TK mRNA表达，但转染pCL3-hTp-rX的MRC-5细胞无TK mRNA表达，提示hTERT启动子可以调控自杀基因HSV-TK(在肺癌细胞中靶向表达，可能是肿瘤靶向性基因治疗中比较理想的转录调控元件。
　　关键词：肺癌；自杀基因；端粒酶催化亚单位；靶向性表达
　　中图分类号：R734.2　文献标识码：A　文章编号：1007－7847(2007)03－0273－06
　　
　　人端粒酶催化亚单位(human telomerasecatalytic subunit，hTERT)是端粒酶的重要组成部分，其活性是端粒酶活性的决定性因素，几乎所有分化成熟的正常体细胞均无端粒酶表达，而85％以上的肿瘤细胞中有高水平的端粒酶活性，因此，hTERT基因的表达也具有高度的肿瘤特异性，对端粒酶的深入研究结果显示，hTERT基因表达的调节是多水平的，其中hTERT启动子在转录水平的调控是最主要的调节机制，因此，作为转录调控元件的hTERT基因启动子的转录活性也应该具有高度肿瘤特异性，基于此，如果用hTERT启动子作为基因转录调控元件，来调控治疗基因在肿瘤细胞中特异性表达，有可能实现肿瘤基因治疗的靶向性，这方面的初步研究结果展示了令人鼓舞的前景，本研究采用基因工程方法构建了hTERT启动子调控自杀基因HSV-TK的肿瘤细胞特异性表达载体，以探讨hTERT启动子作为肺癌靶向性基因治疗中转录调控元件的可能性。
　　
　　1 材料和方法
　　
　　1．1　实验材料
　　1．1．1　细胞
　　人肺腺癌细胞株A549和人胚肺成纤维细胞株MRC-5分别引自中国医学科学院上海细胞库和中国典型培养物保藏中心。
　　1．1．2　质粒
　　含SV40启动子和增强子的荧光素酶报告质粒pGL3-Control，由四川大学华西医院感染性疾病中心唐红教授惠赠：含TK基因的质粒PCDNA3-TK由四川大学华西医院车国卫博士惠赠，含1083bp的hTERT启动子的质粒pGL3-hTp由本课题组在前一阶段研究中构建。
　　1．1．3　主要试剂
　　限制性内切酶HindⅢ、Xba I、PCR试剂盒、RT-PCR试剂盒及DNA连接试剂盒DNA LigationKit Ver.2.1均为大连宝生物工程有限公司产品：脂质体Lipofectamine 2000、RNA提取试剂Trizol以及RPMI 1640、DMEM培养基均为Invitrogen公司产品；TK基因PCR引物由北京赛百盛公司合成；细胞基因组DNA提取试剂盒、质粒DNA小量提取试剂盒及PCR反应产物回收纯化试剂盒均购自北京赛百盛公司。
　　
　　1．2　实验方法
　　1．2．1　PCE扩增TK基因
　　以质粒PCDNA3-TK为模板扩增TK基因，TK基因上游引物序列为：5"CCCAAG CTTM CGC GTATGG cTr CGT AC 3"，下游引物序列为：5"CCCTCT AGA CCG GTA TrG TCT CCT TC 3"，上下游引物5′端分别带有HindⅢ、Xba I的酶切位点(用下划线标示)；PCR反应条件为：95℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃1min，30个循环；72℃7min，反应结束后，取PCR产物6μL电泳，并送大连宝生物工程有限公司作DNA测序。
　　1．2．2　pGL3-hTp-TK和pGL3-SV40-TK重组质粒的构建及鉴定。
　　
　　质粒pGL3-hTp和pGL3-control作HindⅢ/XbaI双酶切，用胶回收方法回收酶切产物中去除lu-ciferase基因片段的载体片段(分别约4.2kb和3.6Lb)，并与PCR扩增的TK基因的HindⅢ/XbaI双酶切产物作连接反应(图1，2)；反应液转化大肠杆菌JM-109，用氨苄青霉素筛选阳性菌落，扩增，提取质粒，采用单酶切(HindⅢ)、双酶切(HindⅢ/XbaI)和PCR方法鉴定。
　　1．2．3　转染pGL3-SV40-TK和pGL3-hTD-TK的细胞A549和MRC-5中TK基因表达的检测
　　对数生长期的A549和MRC-5细胞，用脂质体法分别瞬时转染重组质粒pGL3-SV40-TK(阳性对照组)、pGL3-hTp-TK(实验组)和pGL3-hTp(阴性对照组)，转染方法按照Lipofectamine 2000操作说明进行，72h后，提取DNA和RNA，并用PCR和R7-PCR方法检测各转染细胞中TK基因的存在和表达情况。
　　
　　2　结果
　　
　　2．1　TK基因的PCR产物电泳鉴定及DNA测序结果
　　电泳显示，TK基因长度约1.1kb(图3)；DNA测序结果与GenBank中TK基因序列完全一致(Ac- cession NP_044624)，长度为1131bp(图4)。
　　　
　　　　
　　2．2　pGL3-hTp-TK和pGL3-SV40-TK重组质粒的鉴定
　　HindⅢ单酶切显示，pGL3-hTp-TK长度为5.4kb，pGL3-SV40-TK长度为4.8kb；两种质粒HindⅢ／Xba I双酶切均在1.1kb位置出现DNA条带(TK基因)，以两种重组质粒为模板，PCR均扩增出厂K基因片段(图5和图6)。
　　　　
　　2．3　转染细胞中rx基因表达的检测结果
　　转染了质粒pGL3-h7p-TK和pGL3-SV40-TK的细胞株A549和MRC-5基因组DNA，PCR均扩增出TK基因(图7)，说明pGL3-hTp-TK和pGL3-SV40-TK均成功转入A549和MRC-5细胞：TK-PCR实验结果显示：转染pGL3-SV40-TK的A549和MRC-5细胞均有TK mRNA表达，转染pGL3-hTp-TK的细胞中，A549有TK mRNA表达，MRC-5无TK mRNA表达；转染pGL3-hTp的A549和MRC-5细胞均无TKmRNA表达(图8，9)。
　　　　
　　3 讨论
　　
　　自杀基因治疗是近年来肿瘤研究的热点领域之一，也是目前最有可能有效应用于临床的肿瘤基因治疗策略之一，自杀基因是来源于病毒或细菌的一些药物酶基因，如果将他们导人肿瘤细胞， 其表达产物可以将某些无毒或低毒的药物前体转化为细胞毒性药物，影响肿瘤细胞的DNA合成，导致细胞损伤，单纯疱疹病毒的胸苷激酶(HSV-TK)基因是最具代表性的自杀基因，HSV-TK可以使核苷类似物如更昔洛韦，阿昔洛韦等磷酸化，生成环腺苷一磷酸，后者可以被细胞自身的激酶进一步磷酸化成为三磷酸盐，这些三磷酸盐通过DNA多聚酶α加入到DNA复制过程中，可导致DAN复制链终止及诱导DNA单链断裂，在体外实验和动物模型研究中，HSV-TK/GCV系统对多种肿瘤都显示了令人鼓舞的治疗效果；HSV-TK/GCV系统也是目前少数进行了Ⅲ期临床试验的肿瘤基因治疗方案之一，然而，由于HSV-TK/GCV的治疗作用缺乏肿瘤特异性，可能对正常细胞也具有损伤作用，Herraiz等的动物实验显示，HSV-TK/CCV有导致严重肝损害的可能，实现基因治疗作用的肿瘤细胞靶向性，对提高自杀基因治疗方法安全性及其临床应用具重要意义。
　　　
　　应用某些组织特异性或肿瘤特异性基因启动子从转录水平调控目的基因的表达，是实现肿瘤基因治疗靶向性的重要途径，这一方面的研究始于1993年，以往肿瘤靶向性基因治疗研究中应用最多的基因转录调控元件有甲胎球蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)和前列腺特异性抗原(PSA)基因的启动子，大量研究结果证实了这种基因治疗策略具有较强的可行性，但上述启动子在靶向性基因治疗中具有转录活性弱，应用范围窄的局限性，因此，寻找转录活性强、肿瘤特异性高和应用范围广的基因转录调控元件有重要意义，人端粒酶催化亚单位(hTERT)是端粒酶的重要组份，是端粒酶活性的决定性因素，近年来的研究显示，hTERT启动子在转录水平的调控是hTERT基因表达的主要调节机制，国内外有多位研究者成功克隆了hTERT启动子全长序列，并对其结构特点和转录功能作了深入研究，结果显示hTERT启动子的转录活性具有高度的肿瘤细胞特异性，在本课题的前期研究中，我们采用PCR方法成功克隆了1083 bp的hTERT启动子片段，并检测了它在多种肺癌细胞和正常细胞中的转录活性，结果显示hTERT启动子在各种肺癌细胞中均有不同的转录活性，在正常细胞中没有转录活性，在本研究中，我们将自杀基因HSV-TK插入到含SV40启动子和增强子的荧光素酶报告质粒pGL3-Control和我们前期研究中构建的DGL3-hTp质粒中，成功构建成pGL3-SV40-TK和pGL3-hTp-TK重组质粒，使TK基因的表达分别受到SV40启动子和hTERT启动子的转录调控，将pGL3-SV40-TK和pGL3-hTp-TK转入端粒酶阳性的人肺腺癌细胞株A549和端粒酶阴性的人胚肺细胞株MRC-5，PCR实验显示，两种重组质粒都成功转入A549和MRC-5细胞；RT-PCR实验显示转染了pGL3-SV40-TK的A549和MRC-5均有TK mRNA，提示SV40启动子对TK基因的转录调控不具有肿瘤细胞选择性；转染pGL3-hTp-TK的549也有TKmRNA表达，而MRC-5无TK mRNA表达，提示hTERT启动子对TK基因表达的转录调控具有肿瘤细胞特异性，可能是肿瘤靶向性基因治疗中较为理想的转录调控元件。
　　
　　作者简介：唐小军(1973－)，男，四川安岳人，泸州医学院附属医院讲师，博士，从事胸部肿瘤基础研究及临床工作；王艳萍(1966－)，女，四川广汉人，四川大学华西医院副教授，通讯作者，主要从事肿瘤基础研究。