【羊口疮病毒贵州株B2L基因的克隆及其分子特征分析】珍珠口疮颗粒可以不咽

　　摘要：根据已发表的ＯＲＦＶ Ｂ２Ｌ基因序列设计引物，进行Ｂ２Ｌ基因的特异性扩增，并将其克隆到ｐＭＤ１８－Ｔ载体后进行测序。结果表明，贵州株的Ｂ２Ｌ基因长为１ １３７ ｂｐ。核苷酸序列比较、分析，结果表明，贵州株与湖北株（ＧＵ３２０３５１）同源性最高，达９９．１％，与２００３年北美分离株（ＡＹ２７８２０８）和２００３年美国动物园分离株（ＡＹ４２４９７１）同源性最低，为９７．１％，所推导氨基酸的同源性为96.3%~99.5%。说明贵州株Ｂ２Ｌ基因与参考毒株之间差异不大。该研究为贵州省羊口疮病毒疫苗选择提供理论基础。
　　关键词：ＯＲＦＶ；克隆；序列分析
　　中图分类号：Ｓ８５２．６５ 文献标识码：Ａ 文章编号：0439－８114（２０11）09－1842-04
　　
　　Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ Ｉｔｓ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｂ２Ｌ Ｇｅｎｅ ｏｆ Ｏｒｆ Ｖｉｒｕｓ Ｉｓｏｌａｔｅｄ ｉｎ Ｇｕｉzｈｏｕ
　　
　　ＸＩＡＮＧ Ｚｈｉ－ｌｏｎｇ１，ＺＨＵＯ Ｊｉａｎ－ｈｕａ2，ＣＨＥＮＧ Ｚｈｅｎ－ｔａｏ１，3，ＸＩＡＮ Ｓｉ－ｍｅｉ１，3，ＯＵ Ｄｅ－ｙｕａｎ１，3，ＹＩＮ Ｃｈｕａｎ－ｂａｏ１，ＬＩＵ Ｔｉｎｇ－ｊｉａｎｇ１
　　（1.Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｇｕｉｚｈｏｕ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｇｕｉｙａｎｇ ５５００２５，China； 2． Ｔｈｅ Ｂｕｒｅａｕ ｏｆ Ｌｉｖｅｓｔｏｃｋ ａｎｄ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ ｏｆ Ｊｉｎｇｓｈａｎ Cｏｕｎｔｒｙ， Jinshan ４３１８００，Ｈｕｂｅｉ，China； 3． Ｇｕｉｚｈｏｕ Ｉｎｓｉｔｕｔｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｄｉｓｅａｓｅ， Ｇｕｉｙａｎｇ ５５００２５，China）
　　
　　Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ Ｂ２Ｌ ｇｅｎｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ＯＲＦＶ ｓｔｒａｉｎ ｉｎ Ｇｅｎbａｎｋ，ｏｎｅ ｐａｉｒ ｏｆ ｐｒｉｍｅｒ ｗａｓ ｄｅｓｉｇｎｅｄ．Ｔｈｅ Ｂ２Ｌ ｇｅｎｅ ｏｆ ｏｒｆ ｖｉｒｕｓ ｗａｓ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｐｒｉｍｅｒ ｂｙ ＰＣＲ ａｎｄ ｔｈｅｎ ｃｌｏｎｅｄ ｉｎｔｏ ｐＭＤ１８－Ｔ ｐｌａｓｍｉｄｓ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｄ． Ｔｈｅ ａｃｑｕｉｒｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｃｏｎｔａｉｎｅｄ １ １３７ ｂｐ． Ｔｈｅ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ａｎａｌｙｓｉｓ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ ｓｔｒａｉｎ Gｕｉｚｈｏｕ strain ａｎｄ ｔｈｅ Hｕｂｅｉ strain（ＧＵ３２０３５１）ｗａｓ ９９．１％， ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Gｕｉｚｈｏｕ strain ａｎｄ ｔｈｅ Ｎｏｒｔｈ Ａｍｅｒｉｃａｎ ｏｒｆ ｖｉｒｕｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ（ＡＹ２７８２０８）ｉｎ ２００３， ａｎｄ ｉｓｏｌａｔｅｄ strain ｆｒｏｍ ｖａｒｉｏｕｓ ｒｕｍｉｎａｎｔ ｓｐｅｃｉｅｓ ｏｆ ａ ｚｏｏ（ＡＹ４２４９７１） ｉｎ ２００３ ｗａｓ ９７．１％． Ｔｈｅ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｏｆ ｄｅｄｕｃｅｄ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｓｈａｒｅｄ ９６．３％ to ９９．５％． Ｔｈｅｒｅ ｗｅｒｅ ａ ｌｉｔｔｌｅ ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ Gｕｉｚｈｏｕ ｓｔｒａｉｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｖｉｒｕｓ ｓｔｒａｉｎｓ． Ｔｈｅ ｔｅｓｔ ｐｒｏｖｉｄｅｄ ａ ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ ｂａｓｉｓ ｏｆ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｔｈｅ Oｒｆ ｖｉｒｕｓ ｖａｃｃｉｎｅ ｆｏｒ Gｕｉｚｈｏｕ ｐｒｏｖｉｎｃｅ．
　　Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ＯＲＦＶ； cｌｏｎｅ； sｅｑｕｅｎｃｅ aｎａｌｙｓｉｓ
　　羊口疮（Ｏｒｆ）是由羊口疮病毒（Ｏｒｆ ｖｉｒｕｓ，ＯＲＦＶ）引起的绵羊、山羊的一种接触传染性、嗜上皮性、人兽共患的传染病［１］。ＯＲＦＶ在养羊的国家和地区普遍发生，常呈群发性流行［２］，是严重威胁养羊业，具有重要经济意义的病毒病之一［３］。我国甘肃、宁夏、四川、江苏、云南、青海、陕西、山东、内蒙、新疆、贵州、黑龙江等省区均有此病的流行与报道［４－９］。ＯＲＦＶ为痘病毒科（Ｐｏｘｖｉｒｉｄａｅ）、副痘病毒属（Ｐａｒａｐｏｘｖｉｒｕｓ）成员，为有囊膜线性双股ＤＮＡ病毒，基因组大小约１３５．０～１４８．１ｋｂ［１０］， Ｇ＋Ｃ含量约６４％［１１］；目前公认含１６个开放阅读框（ＯＲＦ），由１３０个编码结构蛋白与非结构蛋白的基因组成。在ＯＲＦＶ基因组中，ＢａｍＨⅠ酶切片段的Ｂ２Ｌ基因（靠近Ｇ和Ｅ片段，距基因末端约１０ ｋｂ处，长约１ １３７ ｂｐ）是一个完整的阅读框，Ｂ２Ｌ基因编码４２ ｋＤａ蛋白质。该蛋白是病毒囊膜的成分之一，可刺激机体产生强烈的抗体反应，并刺激淋巴细胞释放［１２］，是ＯＲＦＶ的保护性抗原之一［１３］，４２ ｋＤａ蛋白诱导的免疫反应足以抵抗强毒的攻击。本试验针对羊口疮病毒的Ｂ２Ｌ基因设计特异性的引物，对贵州株进行ＰＣＲ扩增，并进行分子特征分析，旨在了解羊口疮贵州株与国内毒株及国际毒株间的差异，以便深入了解羊口疮贵州株的分子特性，为羊口疮的诊断及防治奠定基础。
　　１材料与方法
　　１．１材料
　　ＯＲＦＶ贵州分离株采自于镇远某发病羊场，由贵州省动物疫病研究室实验室保存。
　　１．２引物
　　本试验参考ＧｅｎBａｎｋ中的ＯＲＦＶ的Ｂ２Ｌ基因的全基因序列，设计了１对特异性引物为：ＯＲＦＶ（Ｆ）：５′－ＡＴＧＴＧＧＣＣＧＴＴＣＴＣＣＴＣＣＡＴＣ－３′；ＯＲＦＶ（R）：５′－ＴＴＡＡＴＴＴＡＴＴＧＧＣＴＴＧＣＡＧＡＡＣＴ－３′。预期目的片段为１ １３７ ｂｐ。以上由宝生物工程（大连）有限公司合成。
　　１．３病毒ＤＮＡ的抽提
　　将病料痂皮研磨，按１∶１０的体积比加入含双抗（青霉素、链霉素各２ ０００ ＩＵ／ｍＬ）的０．０１ ｍｏｌ／Ｌ ｐＨ值７．２ ＰＢＳ缓冲液中，置４℃冰箱浸渍１２～１６ ｈ，
　　１２ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心１０ ｍｉｎ，取上清，采用ＳＤＳ－蛋白酶Ｋ法提取ＤＮＡ。
　　１．４ＰＣＲ扩增
　　ＰＣＲ反应体系如下：ｄｄＨ２Ｏ ３３ μＬ，１０ × ｂｕｆｆｅｒ ５ μＬ，ｄＮＴＰｓ（各１０ ｍｍｏｌ／Ｌ）１ μＬ，ＭｇＣｌ２（２５ ｍｍｏｌ／Ｌ）３ μＬ，上、下游引物各２．５ μＬ（１０ ｐｍｏｌ／μＬ），模板２ μＬ，Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶１ μＬ（２．５ Ｕ／μＬ），总体积为５０ μＬ。ＰＣＲ反应条件为：９４℃预变性５ ｍｉｎ；９４℃变性１ ｍｉｎ，５５℃退火４５ ｓ，７２℃延伸１ ｍｉｎ，３５个循环后，７２℃延伸１０ ｍｉｎ。取扩增产物８ μＬ，于含有０．５ ｍｇ／Ｌ溴化乙锭的１％琼脂糖凝胶上电泳检测。
　　１．５ＰＣＲ产物回收、连接转化
　　参照宝生物胶回收试剂盒说明书进行。
　　１．６扩增产物的克隆
　　取适量目的片段，加入ｐＭＤ１８－Ｔ载体及高效连接液（ｌｉｇａｔｉｏｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎⅠ），于１６℃连接过夜，取１０ μＬ连接产物转化感受态ＤＨ５α菌，涂布于含Ｘ－ｇａｌ、ＩＰＴＧ和Ａｍｐ的ＬＢ固体平板上，３７℃培养１２～１６ ｈ。经蓝白斑筛选转化菌，ＳＤＳ碱裂解法小剂量制备质粒ＤＮＡ。
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　　以质粒ＤＮＡ为模板，对重组质粒进行ＰＣＲ扩增。
　　１．８重组质粒的酶切鉴定
　　用ＢａｍＨⅠ和ＨｉｎｄⅢ酶切重组质粒（３７℃酶切３ ｈ），１％琼脂糖凝胶电泳观察酶切结果。
　　１．９核酸序列测定
　　采用Ｓａｎｇｅｒ’ｓ双脱氧链终止法测序，将２个反应所测序列用ＤＮＡＳｔａｒ软件包中的Ｓｅｑｍａｎ软件对比矫正，并用ＤＮＡＳｔａｒ的ＭｅｇＡｌｉｇｎ软件对所测核酸序列进行比较和分析。
　　２试验结果
　　２．１ＰＣＲ扩增结果
　　用设计的特异性引物扩增本实验室保存的羊口疮病毒，将扩增产物用琼脂糖凝胶电泳分析，得到与预期相符的１ １３７ ｂｐ片段（图１）。
　　
　　２．２重组质粒ＰＣＲ鉴定结果
　　用设计的特异引物对重组质粒进行ＰＣＲ扩增，得到与预期相符的１ １３７ ｂｐ片段，结果见图２。
　　
　　２．３重组质粒酶切鉴定结果
　　用限制性内切酶ＨiｎｄⅢ和ＢａｍＨⅠ对重组质粒进行鉴定，３７℃ 3 ｈ后，用琼脂糖凝胶电泳分析酶切结果，结果显示切出ｐＭＤ１８－Ｔ载体的２ 70０ ｂｐ和Ｂ２Ｌ基因的１ ２００ ｂｐ两条带，与预期结果相符（图３）。
　　２．４序列测定结果
　　将经ＰＣＲ鉴定为阳性重组质粒的克隆菌送宝生物工程（大连）有限公司进行序列测定，并应用计算机软件对测得的序列进行拼接，获得ＯＲＦＶ贵州株Ｂ２Ｌ基因核苷酸序列，Ｂ２Ｌ基因的长度为１ １３７ ｂｐ，其核苷酸序列见图４。
　　２．４．１贵州分离株与其他分离株核苷酸同源性 将本试验克隆测序的１株贵州分离株与１７株Ｇｅｎｂａｎｋ中已发表的羊口疮Ｂ２Ｌ基因进行比较分析，与Ｇｅｎｂａｎｋ中已发表羊口疮序列间的核苷酸同源性为９７．１％～99.1%（图５）。
　　２．４．２贵州分离株与其他分离株氨基酸同源性本试验克隆测序的羊口疮贵州株Ｂ２Ｌ基因与ＧｅｎBａｎｋ中已发表的羊口疮Ｂ２Ｌ基因进行比较分析，与ＧｅｎBａｎｋ中已发表的羊口疮序列间的氨基酸同源性为９6．3％～９９．５％（图６）。
　　２．４．３遗传进化树分析用Ｏｌｉｇｏ软件绘制羊口疮病毒Ｂ２Ｌ基因的遗传进化树，经分析，贵州株与ＧｅｎBａｎｋ中已发表的中国台湾２００７年分离株（登录号：ＤＱ９０４３５１）和中国湖北２００９年分离株（登录号：ＧＵ３２０３５１）的序列为同一病毒株，与２００５年分离于印度山羊的口疮病毒同属于一个进化分支（登录号：ＤＱ2６３３０３和ＤＱ2６３３０４）（图７）。
　　３分析
　　１）羊口疮病毒基因组全长约１３５．０～１４８．１ ｋｂ，不同种、不同毒株略有差异［３］。Ｂ２Ｌ基因编码约４２ ｋＤａ的蛋白，此蛋白是ＯＲＦＶ的囊膜成分，为主要保护性抗原之一，可刺激机体产生强烈的抗体反应。本研究对贵州分离株ＯＲＦＶ Ｂ２Ｌ 基因的测序及分子特征分析，为贵州省的疫苗选择提供理论依据。
　　２）本研究通过提取羊口疮病毒ＤＮＡ进行ＰＣＲ扩增、克隆、分子特征分析，成功地获得了Ｂ２Ｌ基因编码序列，共１ １３７ ｂｐ，编码３７９个氨基酸，与国内外已发表的羊口疮病毒Ｂ２Ｌ基因核苷酸序列同源性高达９９．１％；推导的氨基酸序列与羊口疮病毒Ｂ２Ｌ基因编码的氨基酸同源性高达９９．５％。从同源性的分析结果来看，本试验所研究的１株羊口疮病毒贵州分离株与ＧｅｎBａｎｋ收录的１７株羊口疮毒株该片段的同源性非常高，这说明Ｂ２Ｌ基因具有高度的保守性。
　　３）在本试验中，以所提取的ＤＮＡ为模板，ＯＲＦＶ１、ＯＲＦＶ２为引物，ＰＣＲ扩增得到了一条约
　　１ １３７ ｂｐ的特异条带，与试验设计的预期结果一致。用限制性内切酶ＨiｎｄⅢ和ＢａｍＨⅠ对ＰＣＲ产物进行的双酶切鉴定结果表明，酶切产物中出现２条带，大小分别为２ ７００ ｂｐ的ｐＭＤ１８－Ｔ的线性片段和约１ ２００ ｂｐ的插入片段，这与测序结果相符合，表明在本试验中已获得了羊口疮病毒的Ｂ２Ｌ基因。本研究不仅为病毒分子生物学特性的研究提供了参考依据，还为原核表达载体的构建及其表达产物的免疫生化特性的研究、真核表达载体的构建并作为核酸疫苗防治羊口疮病毒奠定了坚实的基础。
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