柔嫩艾美耳球虫 [大型艾美耳球虫18S,rDＮA部分序列测定与系统发育分析]

　　摘要：从河北某兔场分离大型艾美耳球虫卵囊，ＣＴＡＢ法提取基因组ＤＮＡ。利用艾美耳属球虫１８Ｓ ｒＤＮＡ保守引物，ＰＣＲ扩增大型艾美耳球虫１８Ｓ ｒＤＮＡ片段，产物纯化后测序。将测得的序列用ＤNASｔａｒ软件分析并与ＧｅｎBａｎｋ中公布的１１种兔球虫的相应序列进行同源性比较，绘制系统进化树。结果表明，扩增出大小约为１ ５２２ ｂｐ的１８Ｓ ｒＤＮＡ片段，序列分析显示河北株大型艾美耳球虫１８Ｓ ｒＤＮＡ与ＧｅｎBａｎｋ 公布的大型艾美耳球虫１８Ｓ ｒＤＮＡ比对，同源性达９９．６％；与国外的１１种兔球虫相应序列同源性在９２．４％～９９．６％之间。
　　关键词：大型艾美耳球虫；１８Ｓ ｒＤＮＡ；测序；系统发育分析
　　中图分类号：Ｓ８５２．７２＋３ 文献标识码：Ａ 文章编号：0439－８114（２０11）09－1838-04
　　
　　Ｔｈｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ １８Ｓ ｒＤＮＡ ｆｒｏｍ Ｅimeria ｍａｇｎａ
　　
　　ＦＡＮＧ Ｓｕ－ｆａｎｇ，ＧＵ Ｘｉａｏ－ｌｏｎｇ，ＣＵＩ Ｐｉｎｇ
　　（Ｃｏｌｌｏｇｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｈｅｂｅｉ Ｎｏｒｔｈ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｚｈａｎｇjｉａｋｏｕ ０７５０００，Ｈｅｂｅｉ，China）
　　
　　Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｅ ｏｏｃｙｓｔ ｏｆ Ｅimeria ｍａｇｎａ ｗａｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｆｒｏｍ ａ ｒａｂｂｉｔ ｆａｒｍ ｉｎ Ｈｅｂｅｉ． Ｉｔｓ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｗａｓ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｂｙ ＣＡＴＢ． Ｔｈｅ １８Ｓ ｒＤＮＡ ｇｅｎｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｏｆ Ｅ． ｍａｇｎａ ｗａｓ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｕｓｉｎｇ ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ ｐｒｉｍｅｒ ｏｆ １８Ｓ ｒＤＮＡ ｏｆ Ｅｉｍｅｒｉａ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｄ． Ｔｈｅｎ ｉｔ ｗａｓ ａｎａｌｙｓｅｄ ｂｙ ＤNASｔａｒ ｐｒｏｇｒａｍ ｐａｃｋａｇｅ ａｎｄ ｗａｓ ａｌｉｇｎｅｄ ｗｉｔｈ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｏｔｈｅｒ ｅｌｅｖｅｎ ｓｐｅｃｉｅｓ ｏｆ ｒａｂｂｉｔ－ｉｎｆｅｃｔｉｎｇ Ｅｉｍｅｒｉａ ｉｎ ｔｈｅ ＧｅｎBａｎｋ． Ａｎｄ ｔｈｅｎ ｔｈｅ ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒｅｅ ｗａｓ ｅｓｔａｂｌｉｓｅｄ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｇｅｎｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｗａｓ about １ ５２２ ｂｐ． Ｔｈｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ １８Ｓ ｒＤＮＡ ｏｆ Ｅ． ｍａｇｎａ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ Ｈｅｂｅｉ ａｎｄ ｔｈｅ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ E. magna publicized in GenBank ｗａｓ ｍｏｓｔ ｃｌｏｓｅ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ ｗａｓ ｕｐ ｔｏ ９９．６％； and the monology between Hebei E. magna and the other 11 kinds of Eimeria infecting overseas rabbit was 92.4%~99.6%．
　　Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｅ． ｍａｇｎａ； １８Ｓ ｒＤＮＡ； sｅｑｕｅｎｃｅ； pｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ aｎａｌｙｓｉｓ
　　兔球虫种类的鉴定，传统方法是以卵囊形态、致病性、寄生部位、肠道病变特征等为鉴别指标［１］，现在仍然用于兔球虫病的流行病学等研究。实践证明，单纯形态学鉴定存在一些不足，一方面由于球虫受到遗传和环境等因素的影响，这些鉴别指标有时会发生变化，因而不能作为虫种鉴别的精确指标［２］；另一方面研究过程中不同研究者对同一性状的认知存在主观差异，而且少数形态特征和生理生化指标随着环境的变化而不稳定，造成球虫分类鉴定上的分歧，这就给该病的诊断与防治带来了困难。
　　我国对于兔大型艾美耳球虫分子生物学特性研究的相关报道较少。因此，本研究在大型艾美耳球虫形态学鉴定的基础上，对大型艾美耳球虫目的基因１８Ｓ ｒＤＮＡ采用软件设计一对引物进行ＰＣＲ扩增，通过系统发育分析进一步确立大型艾美耳球虫种。
　　１材料与方法
　　１．１仪器及设备
　　梯度ＰＣＲ扩增仪（美国热电公司，ＩＳ－５５８０３）、高速冷冻离心机（湖南星科科技有限公司，ＴＧＬ－１６ＬＧ）、电泳仪（北京市六一仪器厂，型号ＤＹＹ－２Ｃ）、紫外透射仪（北京市六一仪器厂，型号ＷＤ－９４０３Ｄ）。
　　１．２球虫ＤＮＡ模板的制备
　　将事先分离纯化好的大型艾美耳球虫卵囊（河北株）３ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心１０ ｍｉｎ，弃掉上清后计数，以卵囊数达到５×１０５个／ｍＬ时即可用于基因组ＤＮＡ的提取。取５×１０５个卵囊加入到中号组织研磨器中进行研磨，当９０％卵囊壁破碎后加入１ ｍＬ卵囊裂解液分装于１．５ ｍＬ离心管中，６５℃作用３ ｈ，随后采用酚－氯仿抽提，异丙醇沉淀ＤＮＡ［３］，沉淀用５０ μＬ ＴＥ溶解。
　　１．３ＰＣＲ反应体系
　　根据Ｋｖｉｃｅｒｏｖａ等［4］报道的１８Ｓ ｒＲＮＡ基因序列，设计大型艾美耳球虫引物为：
　　上游５’－ＴＡＧＴＴＧＧＡＴＴＴＣＴＧＴＣＧＴＧＧＴＣ－３’；下游５’－ＣＣＴＴＣＣＧＴＣＡＡＴＴＣＣＴＴＴＡＡＧ－３’。由宝生物工程（大连）有限公司合成。
　　扩增体系：１０ × ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ （Ｍｇ２＋）２．５ μＬ，ｄＮＴＰ ｍｉｘｔｕｒｅ （10 ｐｍｏｌ／μL）２ μＬ，引物（２０ ｐｍｏｌ／μL）０．５ μＬ，Ｔａｑ ＤＮＡ 聚合酶 ０．２５ μＬ，模板ＤＮＡ １ μＬ， 补加去离子水至总体积为２５ μＬ。
　　反应条件：９４℃预变性４ ｍｉｎ进入循环，９４℃变性１ ｍｉｎ，５９℃退火４５ ｓ，７２℃延伸１ ｍｉｎ，共３０个循环，最后７２℃延伸１０ ｍｉｎ。ＰＣＲ产物经３％琼脂糖凝胶电泳，通过紫外透射仪观察并记录结果［３，４］。用
　　ＤＮＡ回收试剂盒［购自宝生物工程（大连）有限公司］回收，ＰＣＲ产物送宝生物工程（大连）有限公司直接测序。
　　１．４ＰＣＲ产物测序、比对
　　将从河北兔粪中分离的大型艾美耳球虫ＰＣＲ产物送宝生物工程（大连）有限公司，下游引物单向测序，测序结果与ＧｅｎBａｎｋ发布的兔大型艾美耳球虫１８Ｓ ｒＤＮＡ序列（登录号：ＥＦ６９４０１６）进行比对。
　　１．５系统发育分析
　　应用ＤNAｓｔａｒ软件中的ＣｌｕｓｔａｌＷ方法将测
　　序结果与ＧｅｎBａｎｋ发布的兔大型艾美耳球虫
　　１８Ｓ ｒＤＮＡ序列进行序列同源性分析，并绘制系统发育进化树。
　　２结果
　　２．１ＰＣＲ扩增结果
　　ＰＣＲ扩增结果显示该株卵囊扩增出清晰的目的条带，约１ ５２２ ｂｐ，无其他非特异性条带出现（图１）。
　　２．２ＰＣＲ产物测序
　　河北株大型艾美耳球虫ＰＣＲ产物经宝生物工程（大连）有限公司测序，结果见图2。
　　
　　２．３序列比对
　　本次共测得１ ４４０个碱基，序列比对结果显示，河北株大型艾美耳球虫的１８Ｓ ｒＤＮＡ部分基因与GenBank发布的兔大型艾美耳球虫１８Ｓ ｒＤＮＡ同源性达９９．6％，共有８处变异，其对应位置分别为：７０Ｇ→Ｓ， ７９Ｔ→Ｃ、 ５４５Ｃ→Ａ，９６３Ｔ→Ｃ， 在１ ４０８、
本文为全文原貌 未安装PDF浏览器用户请先下载安装 原版全文 　　１ ４１４、１ ４２２、１ ４２３位分别插入了Ｃ、Ａ、Ｃ、Ｔ四个碱基。详细结果见图3。
　　２．４国外１１种兔球虫与河北株大型艾美耳球虫１８Ｓ ｒＤＮＡ序列同源性和趋异性
　　通过将河北株大型艾美耳球虫１８Ｓ ｒＤＮＡ序列与国外１１种兔球虫进行同源性和趋异性比较，结果显示，河北株大型艾美耳球虫与国外１１种兔球虫相应序列同源性为９２．４％～９９．６％之间，其中与国外Ｅ． ｍａｇｎａ和Ｅ． ｐｅｒｆｏｒａｎｓ同源性最高（９９．６％）；与Ｅ． ｓｔｉｅｄａｉ同源性最低（９２．４％），详细结果见表1。
　　２．５系统发育分析
　　应用ＤＮＡsｔａｒ软件进行序列同源性分析，并绘制系统发育进化树（图4）。由图4可见，ＨＢ． ｍａｇｎａ和Ｅ． ｍａｇｎａ为同一分支，说明ＨＢ． ｍａｇｎａ与Ｅ．ｍａｇｎａ亲缘关系最近。
　　３讨论
　　１）１８Ｓ ｒＤＮＡ具有高度保守性的特点，该基因序列差异大小代表了物种差异大小，国际上广泛应用其来确定物种的分类地位。对大型艾美耳球虫河北分离株进行１８Ｓ ｒＤＮＡ的测定，１ ５２２ ｂｐ序列测定结果与GenBank发布的兔大型艾美耳球虫１８Ｓ ｒＤＮＡ部分序列比对，同源性达９９．６％。这个研究结果不仅有助于确定国内兔球虫的遗传进化关系［４］，而且进一步表明分离株为大型艾美耳球虫种。
　　２）传统上兔球虫种类的鉴定仍以兔球虫卵囊形态和生物学特征（致病性、病变特征、免疫原性、内生性发育等）作为主要鉴定指标，实践中此方法存在一些不足，尤其在确定球虫的生物学特性时，不仅费时、费力而且存在一些主观因素的影响。系统发育的意义在于建立分类系统和确定亲缘关系［４］，但只根据其１８Ｓ ｒＤＮＡ亲缘关系相似程度，也很难鉴别兔球虫种类，如梨形艾美耳球虫和黄艾美耳球虫两个种（同源性达９９．６％）具有几乎一致序列的１８Ｓ ｒＤＮＡ，不能由此确定它们是一个种。本研究在形态学观察大型艾美耳球虫基础上根据系统发育分析结合亲缘关系进一步确定球虫种类。在没有建立起快速、灵敏、可靠的分子生物学方法之前，应用形态学鉴定和系统发育分析鉴定兔球虫种类具有一定的价值。
　　３）在提取卵囊基因组ＤＮＡ时，卵囊壁的破碎方法有多种，分别为玻璃珠法［３］、超声波法［５］及研磨器法［６］等。本试验也曾用超声波来破碎卵囊壁，在１００Ｗ下，５ｓ／次，间断的超声大约需１ ｈ才能将９０％以上的卵囊壁破碎，破碎时间太长。而研磨器只需约７ ｍｉｎ即可使９０％以上的卵囊壁破碎。在使用研磨器时用研磨器管底部分进行研磨，同时将研磨器置于冰浴中研磨，这样会减少虫卵基因组ＤＮＡ的降解。
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