[大花蕙兰组培快繁技术研究]石斛兰组培快繁技术研究

　　摘要 大花蕙兰多为杂交品种，种子繁殖无法保持其品种特性，且分株能力弱，因而繁殖系数低，繁殖速度慢，故特采用组培技术以提高大花蕙兰的繁殖率。在初代培养过程中，以MS为基本培养基，附加0.5mg/L BA+1.5mg/L NAA作为诱导原球茎培养基，培养效果最佳。在继代培养中，以MS为基本培养基，附加0.5mg/L BA+1.0mg/L NAA作为原球茎增殖培养基，3~4周后，增殖数可以达到64.5。另外，培养基中附加0.5~1.0g/L活性碳，对吸附培养基中的杂质和在培养过程中分泌的醌、酚类物质以及防止外植体褐变，有显著效果。
　　关键词 大花蕙兰；组织培养；快速繁殖
　　
　　大花蕙兰是指原产于印度、缅甸、泰国、越南和我国南部等地区的兰属（Cymbidium）中的一些附生性较强的大花种和主要以这些原种为亲本获得的人工杂交种。由于它们与蕙兰（C.faberi）较相似而花朵硕大，故称为“大花蕙兰”。
　　当前，国内外对大花蕙兰的栽植与开发都很重视。北京、广州、大连和昆明等城市已分别从国外引入大花蕙兰成品苗植株，开展批量栽培生产，而按传统技术繁殖大花蕙兰，繁殖系数很低，重点发展名优品种，迫切需要组培快繁。本研究旨在瞄准市场需求及国内大花蕙兰盆花生产的薄弱环节，利用组织培养技术进行名、优新品种种苗的快速繁殖生产，努力探索试管苗的成苗栽培技术，以便生产大批遗传性稳定的优良品种，供规模化生产之用，从而进一步丰富我国兰花花卉资源，促进盆花商品化生产，以达到提高经济效益之目的。
　　
　　1材料与方法
　　
　　1.1无菌材料的获得
　　将大花蕙兰8~10cm的幼芽从母体上采下，同时选取2~3cm长的幼根。先用自来水流水冲洗1h，用75%的酒精浸泡30s后再置于0.1%升汞溶液中消毒8min，然后用无菌水冲洗5次，用消毒滤纸吸干表面水分，剥除外围小叶，切取0.3~0.5cm长的茎尖，幼根切成0.5~0.8cm长的根段。
　　1.2培养条件
　　以MS为基本培养基，添加细胞分裂素BA、生长素NAA两种成分，每种附加成分设置不同的浓度水平，按正交设计配制9种诱导培养基。
　　9组原球茎诱导培养基配方：①MS+BA 0.1mg/L+NAA 0.5mg/L；②MS+BA 0.1mg/L+NAA 1.0mg/L；③MS+BA 0.1mg/L+NAA 1.5mg/L；④MS+BA 0.5mg/L+NAA 0.5mg/L；⑤MS+BA 0.5mg/L+NAA 1.0mg/L；⑥MS+BA 0.5mg/L+NAA 1.5mg/L；⑦MS+BA 1.0mg/L+NAA 0.5mg/L；⑧MS+BA 1.0 mg/L+NAA 1.0mg/L；⑨MS+BA 1.0mg/L+NAA 1.5mg/L。
　　设计9组原球茎增殖培养基配方：①MS+BA 0.5mg/L+NAA 0.1mg/L；②MS+BA 0.5mg/L+NAA 0.5mg/L；③MS+BA 0.5mg/L+NAA 1.0mg/L；④MS+BA 1.0mg/L+NAA 0.1mg/L；⑤MS+BA 1.0mg/L+NAA 0.5mg/L；⑥MS+BA 1.0mg/L+NAA 1.0mg/L；⑦MS+BA 1.5mg/L+NAA 0.1mg/L；⑧MS+BA 1.5 mg/L+NAA 0.5mg/L；⑨MS+BA 1.5mg/L+NAA 1.0mg/L。
　　每升加入蔗糖30g，琼脂7g。加热融化后调节pH值为5.6~5.8，分别装入三角瓶中。培养室内温度为25~28℃，光照12h，光照强度为1 000~1 500Lx。
　　
　　2结果与分析
　　
　　2.1原球茎的诱导
　　不同浓度的BA、NAA对于诱导原球茎的影响效果不一样，设计BA的浓度分别为0.1mg/L、0.5mg/L、1.0mg/L，NAA的浓度为0.5mg/L、1.0mg/L、1.5mg/L，正交实验每一处理接种15个根段外植体，重复2次，4周后观察记录（见表1）。
　　
　　以根段和茎尖为外植体接种于起始培养基(原球茎诱导培养基)上，接种1周左右幼芽茎尖基部开始膨大，2周后逐渐产生黄绿色、小的瘤状愈伤组织即原球茎，原球茎继续生长，在其周围形成更多的原球茎，接种2周左右幼根切口处开始膨大，3周后逐渐形成淡绿色，小的瘤状原球茎和幼芽诱导的原球茎一样，随着原球茎的生长在其周围形成更多的原球茎，此进程需要1个月左右。
　　比较处理观察后的数据可见BA、NAA对大花蕙兰原球茎的诱导有极其显著的作用，能明显增进外植体形成原球茎。处理6的诱导原球茎的数量最多；处理1诱导原球茎的数量最少。
　　由处理1、处理2、处理3来看，BA浓度较小为0.1mg/L时，NAA浓度的增加对诱导原球茎的数量没有变化；由处理4、处理5、处理6来看，BA的浓度增加到0.5mg/L时，NAA浓度的增加使原球茎的诱导数量明显增加，由30.5增加到37.0；而当BA的浓度继续增加到1.0mg/L时，NAA浓度的增加反倒会抑制原球茎的诱导。
　　由此可见，原球茎的诱导是BA、NAA共同作用的结果，选择合适的浓度至关重要。BA、NAA的最佳浓度分别为0.5mg/L和1.5mg/L，最佳诱导原球茎培养基为MS+BA 0.5 mg/L+NAA 1.5mg/L。
　　2.2原球茎的增殖
　　原球茎的增殖关系到大花蕙兰繁殖速度的快慢、繁殖系数的高低，以MS为基本的培养基，将BA浓度设置为0.5mg/L、1.0mg/L、1.5mg/L。NAA的浓度设置为0.1mg/L、0.5mg/L、1.0mg/L。正交实验以找出适宜的增殖分化培养基，每一处理接种15个切割后的原球茎，重复2次，培养4周后观察记录（见表2）。
　　
　　将上述原球茎切成3mm左右的小块，接种于原球茎增殖培养基上，每3~4周继代1次，增殖系数可达4.3，即3mm的原球茎数量可增殖4.3倍。在原球茎增殖量方面，本研究以每个接种物上所形成的原球茎个数作为计算依据，就原球茎增殖量的计算来说是最为合理的。但是由于原球茎的发育状态不一致，有的原球茎处于发育晚期，体积较大，有的原球茎处于发育早期，体积较小，但在计算增殖量方面是相同的，这样在客观上不可避免地会出现误差。同时，使用肉眼计数时，也会出现人为的误差。
　　由处理1、处理2、处理3可以看出，BA的浓度为0.5 mg/L时，NAA由0.1mg/L的浓度增加到1.0mg/L，原球茎增殖数由50.0增到64.5，增殖倍数由3.33增到4.30，增殖的幅度比较大；由处理4、处理5、处理6可以看出，BA的浓度增加为1.0mg/L时，NAA的浓度增加为0.5mg/L时，原球茎增殖数增加，但当NAA的浓度增加到1.0mg/L时，原球茎增殖数反而下降，说明了高浓度的NAA对原球茎的增殖有抑制作用。
　　由处理 7、处理8、处理9可以看出，BA的浓度增加为1.5 mg/L时，对原球茎的抑制作用比较明显，处理7、处理8、处理9的原球茎增殖数要小于前6组数据，尤其当BA、NAA浓度都达到最高的时候，抑制作用更为明显，原球茎的增殖数降低到最小。因此，适宜的BA、NAA浓度才会对于原球茎的增殖起到良好的促进作用，浓度偏高或者偏低都不利于原球茎的增殖，最佳原球茎增殖培养基为MS+BA 0.5mg/L+NAA 1.0mg/L。
本文为全文原貌 未安装PDF浏览器用户请先下载安装 原版全文 　　在原球茎的增殖过程中，培养物接种3~4d后便开始分泌出一种红色多酚氧化物于培养基中，逐渐地整个培养基也变成红色，培养物的切口处因而变为褐色，此时培养物的生长会受到一定程度的抑制，如果在培养基中加入0.5~1.0g/L的活性炭，可以吸附有害物质，对细胞的生长有利，这些被吸附的有害物质包括琼脂中包含的物质，培养物在培养过程中分泌的醌、酚类红色物质以及蔗糖在高压消毒时产生的羟基糠醛。
　　
　　3讨论
　　
　　3.1原球茎增殖的计算方法
　　由于本试验中所使用的大花蕙兰原球茎培养物不同于愈伤组织或一般的胚性愈伤组织，其增殖在早期形成少量愈伤组织外，这些愈伤组织随后分化形成原球茎。因此，对于原球茎的增加以质量或体积来计量都不是很合理，另一方面以质量或体积来计算原球茎的增殖在实际操作中难度较大，而且增加了污染的可能性。试验表明，原球茎的增殖量是以每个接种物经培养1个月后所形成的原球茎的个数的平均值来计算的。
　　3.2不同切割方式对原球茎增殖的影响
　　不同切割方式对原球茎增殖的影响也不同。试验采用随机分切、纵切、碾压、井字型切割法。经20d培养后观察：随机分切法虽操作快捷，但有大量切割过于碎小的培养块死亡；纵切法操作需细致、费时，但原球茎增殖数多、大小一致；碾压和井字型切割(底部不分开)原球茎增殖时间可缩短、可加快继代，但单个继代原球茎增殖倍数减少。原球茎切块细小、稀疏的培养瓶内群体生长较慢，而切块较大且密集的瓶内群体生长十分健壮，表现类似于群体生长效应。因此切割时不可过细，直径要在2mm以上，每瓶接种15个培养块，可使瓶内营养得以充分利用。原球茎的继代应保持在12~15代以内，因为继代次数过多，原球茎分生能力降低，长势弱化，诱导的试管苗质逐渐变弱，故应及时的更换、诱导新的原球茎，以保持其健壮正常的生活力。
　　3.3BA在原球茎诱导和增殖中的作用
　　BA在兰花组织培养中无疑具有非常重要的作用，特别是在原球茎诱导方面。许多研究表明，原球茎的诱导需要较高的BA质量浓度，如BA可达到10mg/L甚至更高，但BA对原球茎的增殖是否需要同样高质量浓度的BA，不同的研究者得到了各不相同的研究结果。一些研究表明，原球茎的增殖并不需要高质量浓度的BA，高质量浓度的BA可抑制原球茎的分化，这与 BA在细胞分裂素中活性较强有关，BA用量较大，过快地促进细胞分裂，反而对大花蕙兰的原球茎增殖不利。
　　3.4NAA在原球茎增殖中的作用
　　NAA对大花蕙兰原球茎增殖的促进作用明显好于BA。在0.1~0.5 mg/L范围原球茎的增殖指数逐渐提高，NAA 0.5~1.0 mg/L范围原球茎增殖较快，原球茎的状态颜色正常。
　　
　　4结论
　　
　　大花蕙兰多为杂交品种，种子繁殖无法保持其品种特性，且分株能力弱，因而繁殖系数低，繁殖速度慢。因此，我们采用组培技术提高大花蕙兰的繁殖率。在初代培养过程中，以MS为基本培养基，附加0.5mg/L BA+1.5mg/L NAA，作为诱导原球茎培养基，培养效果最佳。在继代培养中，以MS为基本培养基，附加0.5mg/L BA+1.0mg/L NAA作为原球茎增殖培养基，3~4周后，增殖数可以达到64.5。另外，培养基中附加0.5~1.0g/L活性碳，对吸附培养基中的杂质和在培养过程中分泌的醌、酚类物质以及防止外植体褐变，有显著效果。
　　
　　注：“本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文。”
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