蛋鸡白血病的PCR检测和序列分析:淋巴细胞白血病血常规

　　摘要：采用ＰＣＲ方法对某蛋鸡场送检感染鸡进行实验室诊断，针对禽白血病病毒逆转录酶 ３’区域设计鉴定内外源病毒共同下游引物 Ｈ５，针对ＡＬＶ－Ｊ亚群ｇｐ８５囊膜糖蛋白基因保守区域设计上游引物Ｈ７，Ａ－Ｅ亚群ｇｐ８５囊膜糖蛋白基因保守区域设计上游引物ＡＤ１，提取肝脏病料中核酸进行 ＰＣＲ扩增，测序分析结果表明为内源性禽白血病病毒感染。
　　关键词：禽白血病病毒（ＡＬＶ）；内源性白血病；ＰＣＲ鉴定；测序分析
　　中图分类号：Ｓ８５８．３１文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０11）14－2988-03
　　
　　Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ Ｔｙｐｅ ｏｆ Ａｖｉａｎ Ｌｅｕｃｏｓｉｓ Ｃａｒｒｉｅｄ ｏｕｔ by ＰＣＲ ａｎｄ
　　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ
　　
　　ＸＵ Ｑｉｎｇ－ｒｏｎｇ，ＷＡＮＧ Ｚｈｅｎ－ｂａｏ，ＷＡＮＧ Ｘｉ－ｌｉａｎｇ，ＸＩＡＯ Ｙｕｎ－ｃａｉ，ＺＨＯＵ Ｚｕ－ｔａｏ，ＣＵＩ Ｗｅｉ－ｔａｏ，ＢＩ Ｄｉｎｇ－ｒｅｎ
　　（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｈｕａzｈｏｎｇ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗｕｈａｎ ４３００７０，Ｃｈｉｎａ）
　　
　　Ａｂｓｔｒａｃｔ： Lａｂｏｒａｔｏｕｙ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ on ａｆｆｅｃｔｅｄ ｃｈｉｃｋｅｎ ｆｒｏｍ ａ ｌａｙｅｒ ｆａｒｍ was carried out by PCR． Tｈｅ ｃｏｎｇｅｎｅｒｏｕｓ ｄｏｗｎ ｐｒｉｍｅｒ Ｈ５ was ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ３’ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ of avian leucosis virus（ALV），Ｐｒｉｍｅｒ Ｈ７ ｗａｓ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｆｒｏｍ ａ ｗｅｌｌ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｇｐ８５ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｊ ｓｕｂｇｒｏｕｐ； ａｎｄ ｐｒｉｍｅｒ ＡＤ１ ｗａｓ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｇｐ８５ ｏｆ Ａ－Ｅ ｓｕｂｇｒｏｕｐｓ． ＰＣＲ of the three pairs of primers was conducted using ｔｈｅ ＤＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｆｒｏｍ ｌｉｖｅｒ as ｓａｍｐｌｅ． Sequence analysis of PCR products ｐｒｏｖｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｉｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｗａｓ ｃａｕｓｅｄ ｂｙ ｓｕｂｇｒｏｕｐ Ｅ ｏｆ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ａｖｉａｎ ｌｅｕｃｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ．
　　Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： aｖｉａｎ ｌｅｕｃｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ（ＡＬＶ）； ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｔｙｐｅ ｏｆ ａｖｉａｎ ｌｅｕｃｏｓｉｓ； ＰＣＲ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ； ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ａｎａｌｙｓｉｓ
　　
　　禽白血病是由反转录病毒科Ｃ型反转录病毒属禽白血病／肉瘤病毒群病毒（ＡＬ／ＳＶ）所引起的禽类多种肿瘤性疾病的总称，其感染率高，发病率低［１］。是主要以造血细胞恶性增生为特征的一类传染病，包括淋巴细胞性白血病、成红细胞性白血病、成髓细胞性白血病、骨髓细胞瘤病等［２］。根据病毒中和反应形式、宿主范围、囊膜特性及其他标准将其划分为Ａ到Ｊ １０个亚群［３］，其中Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｊ亚群见于鸡。Ａ、Ｂ亚群为常见外源性病毒，主要感染商品蛋鸡，可引起淋巴白血病；Ｃ、Ｄ亚群是极少报道的外源性病毒；Ｅ 亚群为普遍存在的低致病性或无致病性的内源性病毒；Ｊ亚群由Ｓｍｉｔｈｓ等［４］于１９８８年首次从商品代肉用鸡中分离得到，而 Ｊ亚群是一由外源性白血病病毒与内源性Ｅ亚群病毒囊膜基因的重组体。本试验对湖北某鸡场送检鸡通过检测进行了确定性诊断，对致病毒株进行了分子生物学亚群鉴定，现将试验结果报道如下。
　　１材料与方法
　　１．１材料
　　１．１．１病料试验病料来源于湖北仙桃某蛋鸡场。
　　１．１．２仪器与试剂Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶、ｄＮＴＰ均购自宝生物工程（大连）有限公司（ＴａＫａＲａ）；Ｗｉｚａｒｄ?�Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ购自Ｐｒｏｍｅｇａ公司。
　　１．２禽白血病病原核酸鉴定
　　１．２．１病料总 ＤＮＡ样本的提取取病料肝脏组织剪碎，然后与生理盐水按１∶（５~１０）比例进行组织匀浆，８ ５００ ｒ／ｍｉｎ 离心５ ｍｉｎ，使用 Ｐｒｏｍｅｇａ公司 Ｗｉｚａｒｄ?�Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ提取送检血样白细胞 ＤＮＡ，操作步骤按试剂盒说明书进行。通过 ＵＶ－２１００紫外分光光度计测定病料总 ＤＮＡ样本的ＯＤ２６０ｎｍ和ＯＤ２８０ｎｍ值。
　　１．２．２引物引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。根据 ＧｅｎＢａｎｋ上的 ＡＬＶ全基因序列和已发表的参考文献 ［４］，针对ＡＬＶ－Ｊ亚群 ｇｐ８５囊膜糖蛋白基因保守区域和逆转录酶３’－区域分别合成 ２对特异型引物。引物核苷酸序列资料见表１。
　　１．2．３ＰＣＲ扩增取病料总 ＤＮＡ ５ μＬ 作为模板，分别加入１０×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ ５ μＬ，ｄＮＴＰ（１０ mmol/L） １ μＬ，ＭｇＣｌ２（２５ ｍｍｏｌ／Ｌ）３ μＬ，Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶（２．５Ｕ）１ μＬ，上下游引物（２０ μｍｏｌ／Ｌ）各１ μＬ，ｄｄＨ２Ｏ ３６ μＬ，此总反应体积为５０ μＬ。Ｈ７＋Ｈ５、ＡＤ１ ＋Ｈ５两对引物均按下列条件进行扩增：９４ ℃预变性４ ｍｉｎ， ９３ ℃变性１ ｍｉｎ，６０ ℃退火１ ｍｉｎ，７２ ℃延伸１ ｍｉｎ ３０ ｓ（１３个循环，每个循环退火温度降 １ ℃）；随后 ９３ ℃预变性１ ｍｉｎ，４８ ℃退火１ ｍｉｎ，７２ ℃延伸１ ｍｉｎ ３０ ｓ（３０个循环）；７２ ℃延伸１０ ｍｉｎ。ＰＣＲ程序扩增完毕，取５ μＬ 扩增产物经０．８％琼脂糖凝胶电泳检测。
　　１．2．４ＰＣＲ扩增产物回收与测序使用天根公司ＤＮＡ纯化试剂盒回收ＰＣＲ产物，鉴定回收到产物送与南京金斯瑞生物科技有限公司测序。测序结果用ＢＬＡＳＴ软件与ＧｅｎBａｎｋ公布的禽白血病病毒毒株相应基因进行同源性比较。
　　２结果与分析
　　２．１禽白血病病原核酸鉴定结果
　　采集病料肝脏组织提取的总ＤＮＡ样本，ＤＮＡ样本ＯＤ２６０ｎｍ / ＯＤ２８０ｎｍ比值为１．７９，含量为１．５ μｇ／ｍＬ。
　　２．２ＰＣＲ扩增
　　以ＡＤ１＋Ｈ５ 引物进行ＰＣＲ扩增，从病料肝脏组织提取的总ＤＮＡ样本中扩增出分子长为２６３ｂｐ的ＤＮＡ带，ｄｄＨ２Ｏ替代样本作为阴性对照，产物大小与预期扩增长度相符（图１）；以Ｈ７＋Ｈ５引物进行ＰＣＲ扩增，未扩增出片段，说明此病料为Ａ－Ｅ亚型禽白血病病毒感染。
　　２．３ＰＣＲ扩增产物测序分析
　　测序结果用ＢＬＡＳＴ软件与ＧｅｎBａｎｋ上的禽白血病病毒毒株相应基因比较同源性，与内源性Ｅ亚型禽白血病病毒（ＮＣＢＩ登录号ＦＪ７９３５５０．１）的同源性最高，为９９％，基因相似性也为９９％；与外源性Ａ（Ｍ２５３９９．１）、Ｂ（Ｍ１４９０２．１）亚型禽白血病病毒同源性分别为９９％、５４％，基因相似性分别为９６％、９７％（图２）。此鉴定结果证实本病例是由Ｅ亚型禽白血病病毒所引起。
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　　１）２０世纪８０年代后期，在对引起鸡髓细胞性白血病Ｊ亚群禽白血病病毒深入研究的过程中，在鸡的基因组中发现了内源性反转录病毒［５］。其中Ｅ亚群为整合在鸡染色体中一种前病毒ＤＮＡ，在鸡群中普遍存在［６］。外源性ＡＬＶ能诱发肿瘤，可垂直和水平传播［７］，其中Ｃ、Ｄ亚群极为少见［８］，而内源性ＡＬＶ的致瘤性很低，不能产生感染性病毒粒子［９］。但内外源ＡＬＶ的重组将导致高致病性毒株的产生［１０］。
　　２）在本试验中，参考文献［４］，利用引物Ｈ５＋Ｈ７首先区别Ｊ亚群与Ａ－Ｅ亚群，确定为Ａ－Ｅ亚群感染，再将ＰＣＲ产物进行测序，在ＮＣＢＩ中与已有序列进行比对分析，试验结果表明该病例为内源性禽白血病病毒感染。
　　３）到目前为止，该病尚无有效的治疗方法和可供免疫的疫苗。由于该病的传播途径主要是垂直传播，水平传播仅占次要地位。所以，要想有效控制白血病，必须从种禽的净化开始，通过不断的检测、淘汰阳性鸡，建立白血病阴性的种鸡群，才能从源头上控制住商品鸡白血病的发生。
　　
　　参考文献：
　　［１］ 乔彩霞，关云涛，陈洪岩．禽白血病研究进展［Ｊ］动物医学进展，２００３，２４（６）：１８－２１．
　　［２］ 罗明星，周碧君， 史开志， 等． 血管瘤型禽白血病的实验室诊断［Ｊ］.山地农业生物学报，２００９，２８（１）：４６－５０．
　　［３］ ＰＡＹＮＥ Ｌ Ｎ． Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ ｉｎ ａｖａｉｎ ｌｅｕｃｏｓｉｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ［Ｊ］．Ｌｅｕｋｅｍｉａ， １９９２，６（３）：１５０－１５２．
　　［４］ ＳＭＩＴＨＳ Ｌ Ｍ， ＢＲＯＷＮ Ｒ， ＨＯＷＥＳ Ｋ，ｅｔ ａｌ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＰＣＲ） ｔｅｓｔｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｕｂｇｒｏｕｐ Ｊ ａｖｉａｎ ｌｅｕｋｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ［Ｊ］.Ｖｉｒｕｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ， １９９８，５４：８７－９８．
　　［５］ ＢＥＮＳＯＮ Ｓ Ｊ，ＲＵＩＳ Ｂ Ｌ，ＦＡＤＬＹ Ａ Ｍ，ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ｕｎｉｑｕｅ ｅｎｖｅｌｏｐｅ ｇｅｎｅ ｏｆ ｔｈｅ ｓｕｂｇｒｏｕｐ Ｊ ａｖｉａｎ ｌｅｕｋｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ ｄｅｒｉｖｅｓ ｆｒｏｍ ｅｖ／Ｊ ｐｒｏｖｉｒｕｓｅｓ，ａ ｎｏｖｅｌ ｆａｍｉｌｙ ｏｆ ａｖｉａｎ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｖｉｒｕｓｅｓ［Ｊ］．Ｖｉｒｏｌ，１９９８，２：１０１５７－１０１６４．
　　［６］ 刘永松，潘玲．Ｊ亚群禽白血病的研究进展［Ｊ］．家禽科学，２００５ （０３）：１９９－２２１．
　　［７］ ＰＡＹＮＥ Ｌ Ｎ． Ｔｈｅ ｅｍｅｒｇｅｎｃｅ ｏｆ ｓｕｂｇｒｏｕｐ Ｊ ａｖｉａｎ ｌｅｕｃｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ［Ｊ］．Ｌｅｕｋｅｍｉａ，２００３，２７（６）：３６－４５．
　　［８］ 李新华．禽白血病的流行病学特点及防制措施［Ｊ］.养禽与禽病防治，１９９７（０４）：４４－４９．
　　［９］ 周刚，牛成明，司昌德，等．内源和外源性禽白血病病毒鉴别ＰＣＲ检测方法的建立［Ｊ］． 中国预防兽医学报，２０１０，（０７）：５４６－５４９．
　　［１０］ ＪＥＦＦＲＥＹ Ａ，ＷＡＬＩＤ Ｈ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ａｖｉａｎ ｌｅｕｃｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓｅｓ ｉｎ ｃｈｉｃｋｅｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ ｕｓｅｄ ｉｎ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅａｓｌｅｓ ａｎｄ ｍｕｍｐｓ ｖａｃｃｉｎｅｓ［Ｊ］．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２００１，７５（８）：３６０５－３６１２．
　　
　　注：本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文
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