【马奶酒中抗单增李斯特氏菌细菌素产生菌的筛选及鉴定】 李斯特氏菌

　　摘要：从内蒙古传统乳制品马奶酒中分离出１４４株乳酸菌，通过双层琼脂平板扩散法筛选出具有明显抑菌作用的菌株。在排除有机酸、Ｈ２Ｏ２等的干扰后，其中１株乳酸菌的发酵上清液对受试的单核细胞增生李斯特氏菌表现出明显的抑制作用；进一步硫酸铵沉淀、透析及浓缩处理后，其抑菌活性显著增强，说明其代谢产物中含有蛋白质类抑菌物质，可能是细菌素。经生理、生化试验和形态学观察，将该菌株鉴定为屎肠球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃoｍ）。
　　关键词：马奶酒；乳酸菌；细菌素；筛选；鉴定
　　中图分类号：Ｓ８７９．１；ＴＳ２０１．３文献标识码： Ａ文章编号：0439－８114（２０11）08－1659-03
　　
　　Screening for Anti-Listeria monocytogenes Bacteriocin-producing Lactic Acid
　　Bacteria from Koumiss
　　
　　ＷＵ Ｊｉｎｇa，b，ＭＡＮＧ Ｌａｉa，ＨＥ Ｙｉｎ-ｆｅｎｇb
　　（a． Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ａｎｉｍａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ；b． Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Inner Mongolia Agricultural University，Ｈｏｈｈｏｔ ０１００１８， Ｃｈｉｎａ）
　　
　　Ａｂｓｔｒａｃｔ： １４４ ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ ｂａｃｔｅｒｉａ ｓｔｒａｉｎｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ ｆｅｒｍｅｎｔｅｄ ｋｏｕｍｉｓｓ ｗｅｒｅ ｓｃｒｅｅｎｅｄ ｆｏｒ ａｎｔｉ－Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｂｙ ｄｏｕｂｌｅ ａｇａｒ ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ． Ａｆｔｅｒ ｅｌｉｍｉｎａｔｉｎｇ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｏｒｇａｎｉｃ ａｃｉｄ ａｎｄ ｃａｔａｌａｓｅ， ｔｈｅ ｃｅｌｌ ｆｒｅｅ ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ ｏｆ ｏｎｅ ｓｔｒａｉｎ ｎａｍｅｄ ＭＫＢ６３ ｓｈｏｗｅｄ ｓｔｒｏｎｇ ａｎｔｉ－Ｌｉｓｔｅｒｉａ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｗｅｒｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ａｓ Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ ｂｙ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ－ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ． Ａｆｔｅｒ ａｍｍｏｎｉｕｍ ｓｕｌｐｈａｔｅ ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ， ｄｉａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ， ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｗａｓ ｅｎｈａｎｃｅｄ； ｂｕｔ ｔｈｅ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｗｏｕｌｄ ｌｏｓｔ ａｆｔｅｒ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｔｒｙｐｓｉｎ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｍａｔｅｒｉａｌ ｗｈｉｃｈ ｗａｓ ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ ｏｆ ｔｈｅ ｓｔｒａｉｎ ｈａｄ ｔｈｅ ｆｅａｔｕｒｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ， ａｎｄ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｃｌａｓｓｉｆｉｅｄ ａｓ ｂａｃｔｅｒｉｏｃｉｎ．
　　Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｋｏｕｍｉｓｓ； ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ ｂａｃｔｅｒｉａ； ｂａｃｔｅｒｉｏｃｉｎ； ｓｃｒｅｅｎ； ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ
　　
　　马奶酒是一种以鲜马奶为原料，经乳酸菌和酵母菌共同发酵而成的乳酸－酒精发酵乳饮料，它在我国草原游牧民族中有着悠久的历史。能够舒筋活血、驱寒通络、排毒、消食健胃、促进新陈代谢、增强肝脾功能和提高人体免疫力［１－３］。马奶酒所具有的医疗保健作用与其所含有的微生物菌群有着密切的关系。
　　乳酸菌（Ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ ｂａｃｔｅｒｉａ，ＬＡＢ）是一类能从可发酵碳水化合物（主要是指葡萄糖）中生产大量乳酸的细菌的通称［４］，它们广泛存在于人和禽畜的肠道、食品、物料及少数临床样品中。乳酸菌代谢能够产生有机酸、过氧化氢、双乙酰和细菌素等多种抗菌物质。这些抗菌物质通过抑制腐败菌和病原菌的生长而防止腐败，现已被广泛应用于食品加工、医药保健、饲料发酵及畜禽疾病防治等方面［５，６］。细菌素是在乳酸菌代谢过程中通过核糖体合成机制产生的，并分泌到环境中的一类对革兰氏阳性菌具有抑制作用的杀菌蛋白或多肽，主要抑制同源的细菌，产细菌素菌株自身对细菌素具有免疫性 ［７，８］。同时，细菌素以其无毒性、对热稳定、易被人体消化道分泌的酶降解等特性，被公认为是具有潜在开发能力的天然食品防腐剂和饲料添加剂［９，１０］。目前已被分离获得并实际应用的乳酸菌细菌素有双球菌素、乳酸链球菌素、乳杆菌素等［１１］。
　　近年来，随着分子生物学和生物技术的发展及国际上对食品安全问题的日益关注，开发乳酸菌素作为新型的天然食品防腐剂、饲料添加剂和医药用剂已成为研究热点。因此，筛选出具有高活性的细菌素产生菌株具有重要的理论和实践意义。本研究以内蒙古传统发酵乳制品马奶酒为材料，分离筛选具有抑菌作用的乳酸菌，在种的水平上对其进行鉴定，以期得到具有优良特性的细菌素产生菌。
　　１材料与方法
　　１．１材料
　　１．１．１马奶酒内蒙古地区牧民家庭中以传统发酵法制作的马奶酒样品，样品取回后于４℃贮藏备用。
　　１．１．２指示菌单核细胞增生李斯特氏菌（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ ＣＭＣＣ５４００２）由内蒙古农业大学食品科学与工程学院实验室提供。
　　１．１．３试剂培养基：ＭＲＳ固体、液体培养基，胰酪蛋白胨液体培养基［１２，１３］，乳酸菌鉴定用系列培养基［１４］，分别依文献介绍的方法配置。胃蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶Ｋ、溶菌酶，购于北京Ａｍｅｒｓｃｏ公司。
　　１．２方法
　　１．２．１乳酸菌的分离与培养将采集的２５种样品各取１ ｇ左右加入到９ ｍＬ无菌生理盐水试管中，连续１０倍递增稀释，取１０－４、１０－５、１０－６稀释度的混悬液１５０ μＬ，分别滴加到改良ＭＲＳ琼脂培养基（含２．５％ ＣａＣＯ３）表面，用玻璃棒均匀涂抹，于３７℃培养４８ ｈ，观察菌落形态是否有溶钙圈。挑选有ＣａＣＯ３溶解圈的菌落划线接种到改良ＭＲＳ琼脂斜面。将４８ ｈ纯培养菌落做革兰氏染色，选取革兰氏阳性、接触酶阴性菌株菌，４℃冰箱保存备用。
　　１．２．２乳酸菌上清液的制备用接种环挑取保存的乳酸菌接种于ＭＲＳ液体培养基中，３７℃ 静置培养３６ ｈ，测定培养液的ｐＨ值，并取发酵液经８ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心１５ ｍｉｎ（４℃），取上清液用０．４５ μｍ滤菌器过滤灭菌，得无细胞发酵上清液，冰箱４℃保存备用。
　　１．２．３指示菌的活化培养及菌悬液的制备将保存的单核增生李斯特氏菌接入胰酪蛋白胨液体培养基，其余的指示菌均挑单菌落接入营养肉汤培养基中，３７℃培养箱中培养２０ ｈ后以２％的接种量再活化１代，用０．８５％无菌生理盐水梯度稀释，制成１０６ ＣＦＵ／ｍＬ菌悬液，冰箱中４℃保存待用。
　　１．２．４产抑菌物质乳酸菌的筛选
　　１）抑菌试验方法。采用双层琼脂平板扩散法检测待检菌发酵上清液中是否含有抑菌物质。即在灭菌平皿内倒入１０ ｍＬ ２％的灭菌水琼脂，待琼脂冷却后放入灭菌的牛津杯中，将０．１ ｍＬ含菌约１０６ ＣＦＵ／ｍＬ的指示菌悬液加入到２０ ｍＬ ５０℃的指示菌培养基中，混合培养，倒入平皿中。培养基凝固后，用无菌镊子取出牛津杯，加０．２ ｍＬ乳酸菌上清液，室温扩散３～５ｈ，３７℃ 培养１２～１８ ｈ，设３个重复，以未接菌的ＭＲＳ液体培养基作对照，用游标卡尺测量抑菌圈的直径。选取抑菌活性高的菌株做复筛试验。
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　　３）排除过氧化氢的影响。将发酵上清液在８０℃保温１０ ｍｉｎ来排除过氧化氢的干扰，采用双层琼脂平板扩散法检测乳酸菌发酵上清液的抑菌活性。
　　１．２．５菌株产细菌素的鉴定
　　１）硫酸铵沉淀粗提。透析袋的处理方法：商品透析袋先用５０％乙醇煮沸１ ｈ，再依次用５０％ 乙醇、０．０１ ｍｏｌ／ｍＬ碳酸氢钠和０．００１ ｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ溶液洗涤，最后用去离子水冲洗即可使用。
　　对上步筛选得到的菌株进行产细菌素的鉴定试验。将硫酸铵粉末缓慢加入５０ ｍＬ离心上清液中，边加边搅拌，使最终饱和度为６０％，可看到有絮状沉淀出现，置于４℃冰箱中静置沉淀过夜，８ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心１５ ｍｉｎ，４℃冷冻离心２０ ｍｉｎ，将沉淀物按１∶１０比例溶解于灭菌去离子水中，做抑菌试验，同时以去离子水作为对照。然后将剩余的复溶液装入３ ５００ Ｄａ的透析袋中脱盐，用去离子水透析过夜，更换３次透析液，然后检测盐析上清液抑菌活性。
　　２）蛋白酶检测抑菌物质的蛋白质性质。将不同蛋白酶配成５ ｍｇ／ｍＬ的溶液，各取０．１ ｍＬ于离心管中，分别无细胞上清液０．４ ｍＬ使酶的终浓度为１ ｍｇ／ｍＬ，其中胃蛋白酶和酸性蛋白酶发酵液的ｐＨ值调至２～３，其他蛋白酶发酵液的ｐＨ值均调至６～７（在其最适ｐＨ值范围内），同时以０．１ ｍＬ缓冲液加入０．４ ｍＬ细菌素液作为对照，３７℃温育４ ｈ，然后以单核细胞增生李斯特氏菌为指示菌，检测抑菌活性。
　　１．２．６产细菌素乳酸菌菌株的鉴定将复筛得到的菌株进行菌落形态和生物学特性试验，参照文献方法鉴定［１５］。
　　２结果与分析
　　２．１乳酸菌的分离和产抑菌物质菌株的筛选
　　从内蒙古传统乳制品马奶酒中共分离出１４４株乳酸菌，其中球菌４５株，杆菌９９株。采用牛津杯双层琼脂法对单核增生李斯特氏菌进行抑菌试验，得到有抑菌活性的菌株８株。
　　乳酸菌在生长过程中代谢可以产生许多具有抑菌作用的物质，如有机酸、细菌素、Ｈ２Ｏ２和双乙酰等，均可分泌到上清液中起到抑制其他菌生长的作用，因此在筛选时就要排除这些干扰因素，确定是细菌素引起的抑菌作用。本研究将初筛菌株的发酵上清液用１ ｍｏｌ／Ｌ ＮａＯＨ溶液中和ｐＨ值至６．０，再进行对单核增生李斯特氏菌（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ ＣＭＣＣ５４００２）抑菌试验，并设立ｐＨ值为６．０的乳酸和乙酸作对照。结果表明，ｐＨ 值为６．０的乳酸和乙酸对单核增生李斯特氏菌无抑制作用；在排除有机酸的干扰后和过氧化氢及菌体细胞的干扰试验后，受试菌中只有３株乳酸菌对单核增生李斯特氏菌仍然保持一定的抑菌活性，这说明发酵上清液中还有其他抑菌活性物质的存在。其中有１株乳酸菌对单核增生李斯特氏菌表现出较好的抑菌作用，因此选定ＭＫＢ６３作为下一步试验的测试菌。
　　
　　２．２菌株产细菌素的鉴定
　　２．２．１硫酸铵沉淀粗提硫酸铵通常用于蛋白质的盐析，一般细菌素在６０％饱和度时即大部分沉淀。透析袋处理通常用于蛋白质的脱盐，可以使小分子盐类物质（有机酸等）渗出袋外，从而达到纯化蛋白的目的。本试验对筛选得到的１株细菌素产生菌的发酵上清液进行硫酸铵盐析和透析处理，发现抑菌活性仍然存在，而且抑菌活性显著增强。其抑菌试验结果见图１。
　　２．２．２蛋白酶敏感性取少许胃蛋白酶、溶菌酶、胰蛋白酶和蛋白酶Ｋ酶溶液与发酵上清液混合，使酶浓度为０．５ ｍｇ／ｍＬ，于３７ ℃酶解４ ｈ，进行牛津杯抑菌试验，结果见表２。从表２可以看出，受试的１株菌所产抑菌活性物质对蛋白酶表现出不同的敏感性，但是它们在经胃蛋白酶和胰蛋白酶处理后，均完全失去抑菌活性，基本可以推测，该抑菌活性物质为一类蛋白质类。
　　２．３菌株的鉴定
　　菌株分离纯化后，革兰氏染色阳性，细胞呈球形或卵圆形，一般以双球状或链状排列，菌体大小为（０．６～２．０）μｍ×（０．６～２．５）μｍ，不生芽孢，兼性厌氧。在ＭＲＳ固体培养基上３７℃培养２４ ｈ后，形成圆形光滑、乳白色、不透明的小菌落。乳酸菌的菌体形态如图２所示。
　　菌株ＭＫＢ６３的生理生化试验结果如表３所示。根据《伯杰氏细菌鉴定手册》和《乳酸细菌分类鉴定及实验方法》，分离到的球菌发酵葡萄糖产酸不产气，均产生Ｌ－乳酸。１０℃和４５℃生长，并生长于ｐＨ值为９．６的６．５％ ＮａＣｌ中，可还原０．１％美兰牛乳，鉴定为Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属的细菌。菌株具有耐热性，发酵甘露醇、蜜二糖，不发酵棉子糖、山梨醇，基本符合文献资料中屎肠球菌的特征，初步确定为屎肠球菌（Ｅnterococcus ｆａｅｃoｍ）。
　　３结论
　　从传统马奶酒中分离出１４４株乳酸菌，其中有３株乳酸菌对单核细胞增生李斯特氏菌具有较强的抑制作用，通过对该菌株发酵上清液中有机酸和过氧化物的排除试验和蛋白酶敏感性试验，得到产细菌素较高的ＭＫＢ６３菌株。经常规生理生化试验和形态学观察，初步鉴定为屎肠球菌，这将为我国乳酸菌细菌素的开发与利用提供丰富的资源。课题组将进一步研究该细菌素的生物学特性及安全性，为其在食品保鲜防腐方面的应用打下基础。
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