[Ｏｐ１８／ｓｔａｔｈｍｉｎ信号调控的研究进展] 原核基因表达调控特点

　　摘　要：Op18/stathmin是一种小分子磷蛋白，通过整合体内外不同信号影响微管动力学变化，从而影响细胞周期，与细胞生长、增殖、分化等密切相关；对肿瘤细胞恶性表型的维持、转移与侵犯等也都至关重要，是一个有望在肿瘤治疗上取得突破的，非常重要的潜在靶标。
　　关键词；Op18/stathmin；微管；细胞周期；信号传导
　　中图分类号：R318　文献标识码：A　文章编号：1007－7847(2007)03－0195－05
　　
　　Op18/stathmin最初被认为是一种传导细胞外信号的磷酸化蛋白质，在淋巴瘤中以及在增殖性的乳腺癌细胞中高表达，Op18/stathmin属于一类负调节微管动力学，伴随磷酸化复合物形成的17kD胞浆蛋白，集成传递不同细胞信号通路，由于它是在不同实验室被独立发现的，所以被叫成不同的名称如p17、p18、p19、19K、pp20、Op18、外胚层素、前体素、LABl8、Op18/stathmin。
　　Op18/stathmin相关蛋白包括在神经系统高表达的SCG，SCGlO，SCuP，RB3及其变异体RB3′，RB3″，主要分布于高尔基体，是神经元特异性的膜相关蛋白，它们均含有一个类似Op18/stathmin高度同源区(stathmin样区，SLD)，Op18/stathmin家族相关蛋白质都能使微管失稳定，磷酸化负调节微管失稳定活性。
　　本文主要介绍关于Op18/stathmin信号调控的研究进展，并阐明其在肿瘤发病机制中的意义。
　　
　　1　Op18/stathmin调节微管动力学的作用机制
　　
　　微管由不断聚合／解聚的α/β微管蛋白异源二聚体构成，Op18/stathmin通过两种机制使微管失稳定，这种动力学失稳定性主要依靠聚合与微管蛋白解聚转换实现，有丝分裂间期，微管相对长而稳定，动力学变化较慢，进入有丝分裂期，间期的微管阵列解聚，接着重新聚合成纺锤体，微管变为具有高度动力学活性，
　　微管解聚与聚合发生在微管末端，Op18/stathmin主要作用于微管“+”末端(微管主要的生长点，“－”末端黏附于中心体)，Op18/stathmin通过捕获微管蛋白异二聚体和减少游离的微管蛋白的浓度，减慢微管末端的聚合速度实现，Op18/stathmin捕获游离微管蛋白与解聚微管蛋白的功能区是分离的，清除Op18/stathmin的C-末端(△100-147)发现Op18/stathmin不再能捕获微管蛋白但能继续刺激微管聚合，截断Op18/stathmin的N-末端(△5-25)，Op18/stathmin丧失促进微管聚合活性，却能捕获微管蛋白，因此，Op18/stathmin存在两个不同的调节微管动力学的功能区。Op18/stathmin N-末端有白发的活性，过表达N-末端能导致间期微管失稳定，细胞阻滞于中期，伴随致密的短微管，电子显微镜与数字影像分析发现，是以T2S复合物形式与微管蛋白相互作用，即2mol微管蛋白结合1mol的Op18/stathmin，磷酸化Serl6与Ser63的Op18/stathmin结合游离微管蛋白能力减低，丧失解聚微管能力，其它的磷酸化位点的组合也能减少其失稳定微管活性。
　　
　　2　细胞内、外信号依赖的Op18/stathmin信号通路的调控
　　
　　2．1　MAPK对Op18/stathmin信号调控
　　野生型与突变型Op18均能结合一系列激酶，这些激酶涉及两个不同的脯氨酸导向的家族，能被生长因子受体激活的丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)和细胞周期素依赖激酶(CDK)，Op18/stathmin可能是受体与调节细胞周期激酶的共同底物，研究显示它们分别优先作用于的Ser25与Ser38磷酸化作用位点，抗原受体刺激通常作用于的Ser25磷酸化作用位点。
　　MAPK为连接外界信号与细胞内反应的纽带，是细胞内信号传导链的重要整合点，将胞外刺激与胞内信号分子联系起来，放大初始信号，激活效应分子，诱导细胞增殖、分化与生存；MAPK家族中已经明确的4条信号传递通路，ERK1/2、JNK、p38、ERK5亚家族，活化后可磷酸化转录因子和其他蛋白激酶等多种底物，调节基因转录，参与细胞生长分化、细胞周期调节和细胞凋亡；CDK则直接影响细胞周期进程，Op18的两个磷酸化位点Ser25/Ser38后都带有一个脯氨酸残基，成为好的MAPK底物，激活的p38δ，ERK，JNK均能磷酸化Op18 Set25/Ser38位点，p38δ磷酸化Op18能力最强，JNK最弱，朊病毒蛋白PrPC能通过EGFR诱导ERK1/2磷酸化和Op18 Ser16磷酸化，诱导细胞增殖与生存，研究证实在PCI2细胞，p38α、β、γ、δ在体外都能直接磷酸化Op18 Ser25残基，参与TNF(肿瘤坏死因子)、ROS(活性氧介质)等诱导的ASKl(凋亡信号调节激酶1)-p38 MAP Kinase级联反应的死亡信号传导，Op18/stathmin磷酸化还受能活化的MAPK家族的许多刺激如IL-1β、渗透压、紫外线、H2O2的影响，p386主要被细胞内的刺激与炎性细胞因子激活；凋亡信号调节激酶1(ASKl)也被证明是一种MAPKK，能活化JNK和p38，通过Op18/stathmin调节微管动力学。
　　
　　2．2　p53调控
　　报告基因分析发现p53抑制Op18启动子活性，下调Op18表达，许多有害刺激同样也会导致p53表达增加，功能活化P53负性调节Op18的表达，持续的Op18高表达会越过p53介导的G2/M期阻滞。
　　
　　2．3　p34cdc2(CDKI)调控
　　有丝分裂诱导的重要的激酶p34cdc2，与不同的细胞周期素相作用控制细胞周期的C1/S与G2/M期，抗p34cdc2抗体能抑制增殖的HL细胞进入有丝分裂期，p34cdc2主要磷酸化Op18的Ser25靶点，其次为Ser38，Op18-25A/38A靶点突变，导致缺陷细胞快速G2期聚集过渡，大约1/3细胞进入M期，大量细胞缺乏M期进入S期， 引起有丝分裂M期染色体分离缺陷，影响细胞分裂，p34～2激酶活性受Cyclin B1周期性表达，cdc25磷酸酶等影响。
　　
　　2．4　Stat3调控
　　Stat3与肿瘤的生长和移行密切相关，在多数肿瘤中活性增高，是一种新发现的与stathmin C-作用蛋白，Op18与Stat3相互作用只与Stat3表达有关，stathmin表达不能干扰Stat3磷酸化、核移位、转录活性，Star3-缺陷细胞也不影响细胞周期 的分布，却能影响stathmin失稳定微管活性，从而影响细胞的移行与进犯。
　　
　　2．5　Survivin调控
　　有文献谈到构建survivin启动子驱动的stathmin siRNA能抑制stathmin表达，导致细胞G2/M阻滞，细胞凋亡明显增多，p53可以通过氨基末端负性调控Survivin启动子，同抑制Op18启动子一样下调Survivin表达。
　　
　　2．6　PLKs调控
　　PLKl(Polo-like kinases)是一类主要的丝氨酸／苏氨酸激酶(serine/threonine kinase)，PLKs在酵母与真核生物中高度保守，参与细胞周期调节，主要作用是在细胞进入有丝分裂期(M)对双极纺锤体构成，准确的染色体分离及胞质分裂有关，过度表达或表达抑制都会引起严重的有丝分裂异常，PLK调控Op18通路作用：间接与主要的有丝分裂激酶CDKl-CyclinBl(cdc2激酶)或MPF(Mphase promoting factor)相互作用，然后通过cdc2激酶调控Op18磷酸化，聚合或解聚微管。
　　在有丝分裂前期，cdc2激酶Thr14/15磷酸化失活，进入有丝分裂期(M)，PLKI超磷酸化cdc25使cde25被激活，Plkl与PPl和PP2A蛋白磷酸酶(去磷酸化Plkl磷酸化的edc25残基，负调控edc2激酶活性)相互拮抗调节edc25磷酸化与活性，ede25蛋白磷酸酶使p-Thr14/15的cde2激酶去磷酸化而被激活，激活的cdc2又可反馈作用于ede25磷酸化，cde2激酶磷酸化Op18失活其解聚微管活性，影响双极纺锤体构成，准确的染色体分离及胞质分裂，小分子抑制剂抑制Plkl干扰双极纺锤体形成，使着丝粒微管失稳定，而纺锤体微管稳定形成单极化纺锤体，有可能Plkl通过Plkl/edc25/cdc2/Op18通路间接与Op18/statmin磷酸化水平有关。
　　
　　2．7　Rac和cdc42对Op18信号通路调控
　　Rho的GTP酶家族Rho，Rac和cdc42控制所有哺乳动物细胞微丝肌动蛋白结构的形成，它们通过联系细胞外信号重组细胞骨架，在细胞间期，Op18/stathmin通过Rac-Pak(p21活化激酶)途径被磷酸化，如Rac与ede42能被EGF活化，导致Op18/stathmin的Ser16位点的磷酸化，抑制OP18/stathmin失稳定微管的作用，二者通过它们共同的下游靶标Ser/Thr激酶p65PAK依赖的磷酸化Op18/stathmin，调节肌动蛋白与微管细胞骨架动力学作用，刺激微管网络的生长，反过来，Rac也能被生长微管活化及解聚微管失活，但单独的活化的PAK不足以介导细胞骨架的变化，可能还存在其它平行通路或PAK仅仅是局部活化。
　　
　　2．8　其它
　　微管形成本身也能诱导Op18/stathmin在非洲蟾蜍卵提取物中磷酸化，Op18/stathmin磷酸化与微管网络之间可能存在一个阳性反馈环路。
　　较早前已经发现，cAMP活化的PKA(cAMP依赖的蛋白激酶A)也能磷酸化Op18/stathmin的Serl6与Ser63位点，Op18/stathmin也是CaMII，CaM IV/Gr(Ca离子／钙结合蛋白依赖蛋白激酶)磷酸化底物，对细胞的增殖分化起重要作用。
　　
　　3　Op18/stathmin信号调控与细胞生物学功能的维持
　　
　　微管是细胞骨架的主要成分，对维持细胞的形状、细胞内的运输、细胞黏附与移行、细胞增殖、分化与死亡至关重要，Op18/stathmin整合细胞内外不同的信号通路调节微管动力学，对细胞生物学性状的维持至关重要。
　　
　　3．1　影响细胞周期
　　微管的聚合／解聚对细胞周期的正常进行是必须的，Op18/stathmin转换微管聚合／解聚的活性是通过磷酸化／去磷酸化来实现，在有丝分裂开始，呈放射状间期微管阵列的解散，高度动力学微管变稳定，围绕致密染色体重新聚合形成一个两极的纺锤体结构，Op18/stathmin通过调节纺锤体形成，准确分离染色体而在细胞分裂中起重要作用。
　　Op18受细胞周期与细胞表面受体磷酸化调节，4个Ser残基都受CDK调节，主要位点为Ser25/Ser38，人工诱导Op18-S25A、38A导致G2/M阻滞，Ser16/Ser63有不确定蛋白激酶磷酸化，S16A、S63A、S25A、S38A突变体导致G2/M细胞阻滞与M期核型特征，通过Op18磷酸体分析，认为Ser16/Ser63磷酸化对G2/M期过渡是必须的。
　　最早发现Op18/stathmin在细胞周期调节中起重要作用是通过观察K562红白血病细胞进入有丝分裂期时，Op18/stathmin磷酸化水平增加，在细胞被阻滞于G1/S时，Op18/stathmin磷酸化水平显著降低，p34cdc2磷酸化靶点突变的过表达的Op18/stathmin不能通过磷酸化失活，导致细胞阻滞于细胞周期的G2/M期及功能性的纺锤体形成障碍，这种突变的蛋白过表达引起染色体的随机分布，使染色体分离受阻，Op18/stathmin表达缺陷的细胞也阻滞于G2/M期，反义RNA抑制Op18/stathmin在K562白血病细胞的表达，细胞仍可进入有丝分裂期，构成不典型的纺锤体，不能完成有丝分裂，Op18/stathmin过表达抑制纺锤体形成是在有丝分裂的早期，表达缺陷是在有丝分裂后期干扰纺锤体的功能，Op18/stathmin去磷酸化(活性的恢复)对纺锤体的解散及细胞退出有丝分裂后期是必须的，但不能被磷酸化Op18/stathmin突变体(Opl8-AAA，Ser被Ala取代)，也导致纺锤体形成严重缺陷及G2/M阻滞。
　　
　　3．2　影响细胞分化
　　在鼠PC12神经元分化型嗜铬细胞瘤细胞，反义寡核苷酸选择性封堵Op18/stathmin表达，发现尽管神经生长因子(NGF)基因表达不受影响，但NGF刺激PCI2细胞分化为交感神经样神经元受阻。
　　
　　3．3　多倍体的形成
　　在K562细胞多倍体化过程中，Op18/stathmin表达下调，早期诱导其表达对细胞增殖分化是必须的，后期抑制Op18/stathmin表达有增加K562细胞多倍体巨核分化倾向，高水平非磷酸化Op18/stathmin对有效的多倍体化是必须的。
　　
　　3．4　细胞的移行与侵犯
　　Op18/stathmin通过促进微管解聚，捕获微管蛋白抑制微管聚合，果蝇中，Op18/stathmin表达抑制会削弱胚细胞的移行能力；当Op18/stathmin在成年鼠的嗅觉中枢表达下调或过表达时，新形 成的神经原移行能力衰减或增加；同样，在肉瘤细胞，当Op18/stathmin过表达时，细胞移行能力加强，Op18/stathmin表达被抑制时，细胞移行能力降低，同样，p27Kip1能以剂量依赖的方式减少Op18/stathmin捕获微管蛋白能力，Op18/stathmin与p27Kip1相互作用影响微管的稳定性，伴随影响细胞移行；在大部分原发性肿瘤，p27Kip1Op18/stathmin显示高比例(＞1)，而转移性肿瘤比例中小于1，在转移性乳腺癌中都存在HER2过表达(c-erbB2/HER-2/neu基因编码产物p185erb2，是具有酪氨酸激酶活性的跨膜糖蛋白，属于表皮生长因子受体家族成员)，抗HER2的靶向抗体能上调p27Kip1表达，目前抗HER2抗体正作为一种治疗转移性乳腺癌的前沿疗法，在缺乏Op18/stathmin表达的鼠胚成纤维细胞(MEFs)，细胞的移行发生障碍。
　　
　　3．5　细胞增殖
　　Op18/stathmin表达与细胞的增殖密切相关，在HL60细胞被诱导终末分化和停止增殖中，首次证实Op18/stathmin是一种广泛存在，17kDa快速磷酸化的蛋白质，非磷酸化的Op18在细胞增殖中起重要作用，在白血病细胞中，Op18/stathmin高水平表达；增殖的、正常的淋巴细胞中等水平表达；当细胞停止增殖时，Op18/stathmin表达水平大幅度衰减，同样，正常淋巴细胞被诱导增殖Op18/stathmin表达水平显著增加，说明淋巴细胞的增殖与Op18/stathmin表达正相关，在正常的、良性的癌性卵巢组织中，在133例原发性乳腺癌中，大约22％乳腺癌组织Op18/stathmin蛋白与mRNA水平均过表达，明显与肿瘤细胞增殖性相关并显示高度的侵犯性；在实体肿瘤中，相对于高分化低增殖性肿瘤，高增殖性的低分化恶性肿瘤表达更高水平的Op18/stathmin，在人与鼠正常组织中，细胞更新快的组织如睾丸和造血组织，Op18/stathmin高水平表达。特别是上皮组织，增生细胞相对于邻近分化细胞表达水平高，而且在新生组织的表达水平高于成年组织，总之无论正常或恶性细胞，Op18/stathmin表达与细胞增殖密切相关。
　　
　　3．6　细胞死亡诱导
　　TNF诱导肉瘤细胞L929死亡不依赖Caspase活化与细胞色素C的释放而是依赖线粒体产生的活性氧，TNF诱导Op18超磷酸化，TNF主要磷酸化位点为Serl6/63，超磷酸化的Op18导致MT卷曲和延伸，TNF诱导Op18超磷酸化稳定MT促进细胞死亡，说明Op18在将细胞死亡信号传递到线粒体中起重要作用。
　　
　　3．7　转化细胞表型维持
　　癌细胞不依赖底物锚定或血清也能生长，但Op18/stathmin表达衰减后却不再能独立生长，cJun是AP-1转录因子的一个主要成分，介导细胞增殖、分化、凋亡等多种生物学行为，在诱导表达cJun的Rat-1a纤维母细胞，反义寡核苷酸干扰Op18/stathmin表达，能抑制Rat-1a非黏附性生长；Opl8-antisense-RNA抑制Op18表达，细胞丧失血清独立的锚定生长功能和细胞生长阻滞；抑制Op18表达会导致白血病细胞肿瘤原型的显著抑制，高水平的Op18对维持转化细胞表型是必须的。
　　
　　4　问题与展望
　　
　　Op18/stathmin过表达或表达抑制均不影响细胞进入有丝分裂期，但影响细胞分裂与分化，具体的作用机制不清：真核细胞的多核巨细胞均呈Op18/stathmin表达下调，导致形成不典型纺锤体，诱导多倍体分化倾向，多数肿瘤细胞也呈现多核，但Op18/stathmin表达却正常或异常偏高；不同类型细胞表达Op18/stathmin差别很大，对细胞周期调控作用是否也存在差别，机制怎样：Op18/stathmin高表达是否一定与肿瘤细胞高增殖性有关，是什么样的机制导致增生快的组织性中高表达；PPl作用的底物不是Op18/stathmin，但PPl对后期微管延伸与染色体分离非常重要，说明调节微管动力学机制有多种途径：Plkl在有丝分裂期不同阶段，分别位于中心体、染色体、纺锤体及中体上，除了通过磷酸化Op18/stathmin调节有丝分裂纺锤的形成外，还可能有其它多种调节方式；p27kip1与Op18/stathmin作用控制细胞移行作用机制不清，Op18/stathmin在肿瘤细胞一般呈高表达，如果是直接作用，在原发性肿瘤，细胞内的p27kip1浓度足够高抑制Op18/stathmin介导的肿瘤细胞移行与侵犯，但却会引起细胞周期阻滞，影响肿瘤细胞的增殖，如果是间接作用，之间的媒介是什么?在正常胚胎细胞，过表达或表达抑制均有可能削弱细胞的移行能力，所以Op18/stathmin含量在正常细胞是否存在一个动态平衡点，它又与哪些因素有关等等，
　　总之，Op18/stathmin整合传导不同的信号调节微管动力学，而微管直接与亚细胞结构，细胞皮层相互作用，介导细胞表型的维持与细胞的移行，Op18/stathmin通过影响细胞骨架参与调控细胞形态与移行，及肿瘤细胞恶性表型的维持，转移与侵犯等，通过调节微管动力学参与细胞周期，细胞生长与增殖，细胞转化及死亡等各种生物学行为变化，是一个有望在肿瘤治疗中取得突破的、非常重要的潜在靶标，但Op18/stathmin的调控涉及一个非常复杂的网络，目前对Op18/stathmin许多作用机制仍不是很清楚，有待进一步探索，可能我们对Op18/stathmin了解与重视程度与其扮演的重要作用是极不相称的。
　　
　　作者简介：林雪迟(1971－)，男，湖南安乡人，中南大学湘雅医学院肿瘤研究所博士研究生，主要从事肿瘤信号传导研究；曹亚(1951－)，女，湖南长沙人，中南大学湘雅医学院肿瘤研究所教授，博士生导师，通讯作者，主要从事肿瘤分子生物学研究。