拮抗稻瘟病病菌放线菌Amy-627的筛选及鉴定|稻瘟病病菌

　　摘要：菌株Ａｍｙ－６２７是一株从长白山地区分离纯化出的对２２种植物病原真菌和３种致病细菌都有较明显抑制效果的放线菌，其抗菌谱较广，尤其对水稻稻瘟病病菌（Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ ｏｒｙｚａｅ）具有显著的拮抗作用。通过形态特征、培养特征、生理生化检测及抑菌谱等一系列比较。结果表明，发现该菌株与链霉菌属的吸水链霉菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ）的特征基本相符，通过１６Ｓ ｒＤＮＡ序列比对同源性达９９％。根据多项分类原则和系统进化树的构建分析，将该菌株暂归入吸水链霉菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ）类。
　　关键词：水稻稻瘟病病菌；链霉菌；拮抗；筛选；鉴定
　　中图分类号：Ｓ４７６文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０11）14－2864-03
　　
　　Screening and Identification of Amy-627 Strain against Pathogenic Fungus
　　Pyricularia oryzae
　　
　　ＺＨＡＮＧ Ｌｉ，ＷＡＮＧ Ｙｏｎｇ，ＸＩＥ Ｃｈｅｎｇ－ｃｈｅｎｇ，ＧＯＮＧ Ｌｉ－ｊｉｎｇ，ＷＡＮＧ Ｘｕｅ
　　（Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｌｉａｏｎｉｎｇ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ａｎｓｈａｎ １１４０４４，Ｌｉａｏｎｉｎｇ，Ｃｈｉｎａ）
　　
　　Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ａｍｙ－６２７， ａｎ ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅ ｓｔｒａｉｎ， ｗａｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｆｒｏｍ Ｃｈａｎｇbａｉ mｏｕｎｔａｉｎ． Ｉｔ ｈａｄ ｅｘｔｅｎｓｉｖｅ ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｓｐｅｃｔｒｕｍ ｏｆ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｆｉｌｔｒａｔｅ． Ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ ２２ ｐｌａｎｔ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ ａｎｄ ３ ｂａｃｔｅｒｉａ ｗｅｒｅ ｓｔｒｏｎｇｌｙ ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ ｂｙ Ａｍｙ－６２７ ｏｎ ＰＤＡ ｐｌａｔｅ． Ｅｓｐｅｃｉａｌｌｙ， ｔｈｅ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｆｕｎｇｕｓ， Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ ｏｒｙｚａｅ， ｗａｓ ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｂｙ ｉｔ． Ｂｅｓｉｄｅｓ， ｔｈｅ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ， ｃｕｌｔｕｒａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ， ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ－ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ａｎｄ antimicrobial spectrum ｏｆ ｔｈｉｓ ｓｔｒａｉｎ ｗｅｒｅ ｓｔｕｄｉｅｄ comparatively． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ ｔｈｉｓ ｓｔｒａｉｎ ａｎｄ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕ ｗｅｒｅ ｓｉｍｉｌａｒ ａｎｄ ｔｈｅ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅｍ ｗａｓ ９９％ by 16S rDNA sequences’ comparison． Base on ｔｈｅ ｐｏｌｙｐｈａｓｉｃ ｔａｘｏｎｏｍｉｃａｌ study and phylogenetic tree analysis， ｔｈｅ ｓｔｒａｉｎ Ａｍｙ－６２７ ｗａｓ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ａｓ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ for the time being．
　　Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ ｏｒｙｚａｅ； ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅ； ａｎｔａｇｏｎｉｓｍ； ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ
　　
　　放线菌种类繁多，代谢功能各异，是一类有着广泛实际用途的生物资源。在抗菌活性物质的种类中，大约有７０％是由放线菌（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）产生的［１，２］。利用具有生命特征的生物体及其代谢分泌物、复制物（生物源）经工艺加工而成的具有农药功能的有害生物控制剂――农用抗生素类药物，由于具有低毒、高效、选择性强、残留时间短、无公害等优点，正日益受到世界各国的重视，并将成为今后农药行业发展的主要方向之一。
　　水稻稻瘟病是一种世界性病害，在我国绝大多数水稻种植区域均有发生。流行年份一般可造成１０％～２０％的经济损失，严重者可达５０％以上。稻瘟病在水稻整个生长阶段皆可发生，具有危害时间长、侵染部位多和症状多样性等特点，使化学防治难以达到预期的目的。近年来利用有益微生物来防治水稻稻瘟病已成为较流行的策略。放线菌广泛存在于不同的自然生态环境里，现今发现的放线菌只占自然界存在的１０％～２０％，其资源利用还具有相当大的空间。因此，对采自长白山地区不同类型土壤进行了拮抗放线菌的筛选，并对抗菌效果最显著的菌株进行了鉴定，以期为抗菌活性物质的提纯提供试验依据，也为进一步的中试放大及大规模生产打下基础。
　　１材料与方法
　　１．１材料
　　１．１．１菌种５８株放线菌（分离自长白山地区不同类型土壤）及用于发酵液生物检测的２２种植物病原真菌和３种致病细菌由辽宁科技大学生物工程实验室生物制药工艺室提供。
　　１．１．２培养基生物测定培养基：ＰＤＡ培养基、牛肉膏蛋白胨培养基。基础发酵培养基：葡萄糖９．０００ ｇ、玉米粉９．０００ ｇ、黄豆粉９．０００ ｇ、酵母膏１．２００ ｇ、牛肉膏０．３００ ｇ、（ＮＨ４）２ＳＯ４ １．２００ ｇ、ＮａＣｌ ０．６００ ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４ ０．１２０ ｇ、ＦｅＳＯ４ ０．００６ ｇ、ＺｎＳＯ４ ０．００３ ｇ、
　　ＭｇＳＯ４ ０．０６０ ｇ、去离子水３００ ｍＬ，ｐＨ值７．４～７．６。
　　１．１．３主要仪器光学显微镜、电子显微镜、ＰＣＲ扩增仪、核酸电泳仪、蛋白质电泳仪、ＤＮＡ测序仪、高速离心机、恒温摇床。
　　１．２活性菌株的筛选及抗菌谱的测定
　　１．２．１菌株的培养将５８株放线菌接种于高氏一号培养平板内（９ ｃｍ培养皿），２８ ℃培养７ ｄ后取１ ｃｍ直径的菌碟待用。将２２株植物病原真菌和３株致病细菌分别接种于ＰＤＡ培养基和细菌培养基，真菌２５ ℃培养７２ ｈ，细菌３７ ℃培养４８ ｈ待用。
　　１．２．２菌株的筛选采用混菌法［３］对５８株放线菌进行菌体抑菌活性的初筛。以水稻稻瘟病病菌（Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ ｏｒｙｚａｅ）作为指示菌，２５℃培养７２ ｈ，筛选出抑菌活性明显的菌株作为目的生防菌。
　　１．２．３抗菌谱的测定采用杯碟法对初筛得到的菌株进行抗菌谱测定。牛津杯内盛２００ μＬ发酵液，２５ ℃培养７２ ｈ（真菌）、３７ ℃培养４８ ｈ（细菌）后测定抑菌圈直径。
　　１．３菌株鉴定
　　１．３．１形态特征采用插片法，２８ ℃培养７ ｄ，分别用光学显微镜和电子显微镜观察菌丝和孢子形态。
　　１．３．２培养特征和生理生化检测参照《链霉菌鉴定手册》［４］推荐的部分培养基（表４）和方法进行试验，２８ ℃培养１６８ ｈ，观察记录特征［５］。
　　１．３．３１６Ｓ ｒＤＮＡ测序及序列分析用微波法［６］提取Ａｍｙ－６２７菌株总ＤＮＡ，进行１６Ｓ ｒＤＮＡ的扩增，根据１６Ｓ ｒＤＮＡ的结构特点及其保守区设计特异引物（正向引物２７ｆ：５′－ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＡＴＧＧＣＴＣＡＧ
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　　Ｔ－３′）。采用１％（m/v）琼脂糖凝胶对ＰＣＲ产物电泳检测［７］。将目的ＤＮＡ片段与其他ＤＮＡ尽可能分开，回收ＤＮＡ的琼脂块，经连接、转化后，将转化好的菌体穿刺培养，由大连宝生物（工程）有限公司测序。将所得的序列与ＧｅｎＢａｎｋ数据库中的已知序列进行ＢＬＡＳＴ比对，并选取与试验菌株序列相似度较高的菌株，用ＤＮＡｓｔａｒ软件进行序列排列分析，采用Ｂｏｏｔ－ｓｔｒａｐｉｎｇ法对所构建的进化树［８，９］进行评估，确定分离菌株的分类地位［１０］。
　　２结果与分析
　　２．１活性菌株的筛选和抗菌谱的测定
　　将５８株放线菌进行抑菌活性的初筛，大多数菌株抑菌活性很小，但有８株放线菌对水稻稻瘟病病菌（Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ ｏｒｙｚａｅ）有抑制作用，其中菌株Ａｍｙ－６２７的抑制效果最好（表１）。
　　对初筛得到的菌株Ａｍｙ－６２７进行发酵液的抗菌谱测定，发现菌株Ａｍｙ－６２７的发酵液对２２种常见植物病原真菌有不同程度的抑制作用（表２、图１），但对水稻纹枯病病菌、小麦赤霉病病菌却没有效果，并且发酵液对３种致病细菌也有一定的抑制作用（表３）。证明菌株Ａｍｙ－６２７所产生的活性物质的抑菌谱较广，且对不同种类病原菌具有选择性。
　　２．２拮抗菌株Ａｍｙ－６２７的形态学观察
　　通过光学显微镜和电子显微镜观察发现，拮抗放线菌Ａｍｙ－６２７菌株基内菌丝不断裂，无横隔，成分枝状；孢子浑圆至椭圆，表面光滑；孢子丝为松环、初级螺旋、钩状（图２）。
　　２．３拮抗菌株Ａｍｙ－６２７的培养特征和生理生化特征
　　表４为菌株Ａｍｙ－６２７在不同培养基上的培养结果。按常规方法培养观察，拮抗放线菌Ａｍｙ－６２７菌株在马铃薯浸汁、伊莫松、无机盐淀粉等６种培养基上生长良好，菌落为灰白色、不透明、表面成致密丝绒状；气生菌丝体为灰白色，基内菌丝为白色，不产生可溶性色素。生理生化测定结果表明，拮抗放线菌Ａｍｙ－６２７菌株革兰氏染色阳性；明胶液化；牛奶凝固；不水解淀粉；能水解纤维素；硝酸盐还原为阳性；不产生黑色素和Ｈ２Ｓ；能利用葡萄糖、果糖、木糖、肌醇、蔗糖、鼠李糖、甘露醇。
　　２．４拮抗菌株Ａｍｙ－６２７的分子鉴定
　　通过ＰＣＲ方法克隆拮抗放线菌Ａｍｙ－６２７菌株的１６Ｓ ｒＤＮＡ，获得１６Ｓ ｒＤＮＡ近全长序列，共１ ４７５ ｂｐ，电泳结果见图３。ＢＬＡＳＴ相似性分析表明，拮抗放线菌Ａｍｙ－６２７菌株与Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ的１６Ｓ ｒＤＮＡ序列同源性为９９％，拮抗放线菌Ａｍｙ－６２７菌株与相关菌株的系统发育树如图４。由此可见，拮抗放线菌Ａｍｙ－６２７菌株与Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ处于同一分支。
　　３结论和讨论
　　当气温在２０ ℃左右时，遇降雨，稻瘟病病菌便可产生大量分生孢子进行侵染，逐步扩展蔓延。在生产上常用化学农药进行病害防治，但稻瘟病病菌会产生抗药性，从而导致化学防治的失败。研究筛选的放线菌Ａｍｙ－６２７对稻瘟病病菌有较好的抑菌效果，有关菌株的生防效果和抑菌机理方面还有待进一步研究。
　　一般认为，两菌株１６Ｓ ｒＲＮＡ基因序列同源性小于９７％时为不同的种，但同源性大于９７％时也不一定是同一个种。研究序列分析并构建系统发育树，从其同源性高的菌株或系统发育树上可看出，与拮抗放线菌Ａｍｙ－６２７菌株处于同一分支的是Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ，１６Ｓ ｒＤＮＡ序列同源性为９９％，但在形态特征、培养特征和生理生化特性方面存在一些差异，故目前还不能将其完全归为Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ。另外该菌株是否可被看作是农用抗生素的一个新来源，还需要后续试验的进一步验证。
　　
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