抗氧化有效成分 [火炭母有效成分的提取及抗氧化活性研究]

　　摘要：为了探讨火炭母（Ｐｏｌｙｇｏｎｕｍ ｃｈｉｎｅｎｓｅ Ｌ．）有效成分的抗氧化作用，采用超声波辅助手段对火炭母中的有效成分进行了提取，并用Ｈ２Ｏ２/Ｆｅ２＋体系法和邻苯三酚体系法对其抗氧化活性进行了研究。结果表明，当采用甲醇与水体积比为１∶１混合液为提取溶剂时，火炭母提取液具有较高的抗氧化活性，４０ ｇ原材料的提取液对羟自由基的清除效果与６．２９ ｇ维生素Ｃ的作用相当，而对超氧阴离子的清除效果与９．８２ ｇ维生素Ｃ的作用相当。
　　关键词：火炭母；抗氧化；羟自由基
　　中图分类号：Ｑ９４９．７４４；Ｒ２８４．２文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０11）12－2490-03
　　
　　 Effective Component Extracting and Its Antioxidant Activity in Polygonum chinense
　　
　　ＨＵＡＮＧ Ｇｕｏ－ｘｉａ１，ＬＩＵ Ｌｉｕ１，ＷＡＮＧ Ｑｉｎｇ１，ＨＵＡＮＧ Ｚｉ－ｍｅｉ２
　　（１． Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｇｕａｎｇｘｉ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｌｉｕｚｈｏｕ ５４５００６，Ｇｕａｎｇｘｉ，Ｃｈｉｎａ；
　　２．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ａｕｔｏｍｏｔｉｖｅ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｌｉｕｚｈｏｕ Ｖｏｃａｔｉｏｎａｌ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｌｉｕｚｈｏｕ ５４５００６，Ｇｕａｎｇｘｉ，Ｃｈｉｎａ）
　　
　　Ａｂｓｔｒａｃｔ： Iｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ ｓｔｕｄｙ ｔｈｅ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ａｃｔｉｖｉｔｙ，ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ｉｎ Ｐｏｌｙｇｏｎｕｍ ｃｈｉｎｅｎｓｅ Ｌ． ｗｅｒｅ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｂｙ ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ ａｕｘｉｌｉａｒｙ ｍｅｔｈｏｄ， ａｎｄ ｔｈｅ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｗａｓ ｄｅｔｅｃｍｉｎａｔｅｄ ｂｙ Ｈ２Ｏ２/Ｆｅ２＋ ｓｙｓｔｅｍ ａｎｄ ａｄｊａｃｅｎｔ ｐｙｒｏｇａｌｌｏｌ ｓｙｓｔｅｍ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗed ｔｈａｔ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｌｉｑｕｉｄ ｈａｄ ｈｉｇｈｅｒ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｗｈｅｎ ｔｈｅ ｖｏｌｕｍｅ ｒａｔｉｏ ｏｆ ｍｅｔｈａｎｏｌ ａｎｄ ｗａｔｅｒ ｗａｓ １∶１． Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ４０ｇ ｒａｗ ｍａｔｅｒｉａｌｓ ｗａｓ ａｌｍｏｓｔ ｅｑｕａｌ ｔｏ ６．２９ ｇ ｖｉｔａｍｉｎｅ Ｃ ｆｏｒ ｔｈｅ ｒｅｍｏｖａｌ ｏｆ ｈｙｄｒｏｘｙｌ ｒａｄｉｃａｌｓ， ａｎｄ ｅｑｕａｌ ｔｏ ９．８２ ｇ ｖｉｔａｍｉｎ Ｃ ｆｏｒ ｔｈｅ ｒｅｍｏｖａｌ ｏｆ ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ａｎｉｏｎ．
　　Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｐｏｌｙｇｏｎｕｍ ｃｈｉｎｅｎｓｅ Ｌ．； ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ； ｈｙｄｒｏｘｙｌ ｒａｄｉｃａｌ
　　
　　火炭母（Ｐｏｌｙｇｏｎｕｍ ｃｈｉｎｅｎｓｅ Ｌ．）为蓼科（Ｐｏｌｙｇｏｎａｃｅａｅ）植物，生长于水沟边、山谷、湿地上，具有清热利湿、凉血解毒等功效，可用于湿热泄泻、痢疾、黄疸、咽喉肿痛、湿热疮疹、霉菌性阴道炎等病症的治疗［１］，是广东地区常用的中草药。已有人用１０％的火炭母滴眼液治疗角膜薄翳、角膜斑翳等眼疾［２］。火炭母中的药用成分主要为黄酮、生物碱、芳香杂环类化合物等［３］，朱华等发现，火炭母中含有丰富的槲皮素［４］。
　　自由基具有强氧化性，可损坏机体组织和细胞，过量自由基的产生是人体衰老及各种疾病产生的诱导因素之一［５，６］，因此，加速清除体内过多的自由基显得尤为重要［７］。本文采用超声波辅助手段提取了火炭母中的有效成分，并对提取工艺进行了优化，采用Ｈ２Ｏ２/Ｆｅ２＋体系法和邻苯三酚体系法对提取物的抗氧化活性进行了研究，旨在为进一步研究火炭母的理化作用提供依据，以便人们对火炭母这一传统药材有更充分的认识，从而使其开发利用更加科学合理。
　　１材料与方法
　　１．１仪器与试剂
　　火炭母全草采集于柳州市郊，清洗去泥，晾晒２ ｄ后置入烘箱中烘干，用粉碎机粉碎，待用。甲醇、石油醚（６０－９０）、乙酸乙酯、ＰＢＳ缓冲溶液、０．７５ ｍｍｏｌ／ｍＬ邻二氮菲溶液、０．７５ ｍｍｏｌ／ｍＬ硫酸亚铁溶液、０．０１％ Ｈ２Ｏ２、维生素Ｃ标准溶液、０．０５ ｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、０．２ ｍｍｏｌ／Ｌ邻苯三酚、１０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＣｌ等试剂均为分析纯，所用水为去离子水。仪器主要有ＺＮ－５００Ａ中草药粉碎机（长沙市中南制药机械厂）、ＪＹ８８－１超声波细胞破碎机（宁波新芝科器研究所）、ＲＥ－５２０旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）、微波炉（广东格兰仕集团有限公司）。
　　１．２方法
　　１．２．１维生素Ｃ对・ＯＨ清除率标准曲线的绘制在１０ ｍＬ具塞比色管中，依次加入1 ｍＬ ０．７５ ｍｍｏｌ／Ｌ邻二氮菲溶液，２ ｍＬ ｐＨ值７．４的ＰＢＳ缓冲液，1 ｍＬ不同浓度的样品液或维生素Ｃ标准溶液，充分混匀后，再加入1 ｍＬ ０．７５ ｍｍｏｌ／Ｌ硫酸亚铁溶液，混匀后再加入1 ｍＬ ０．０１％ H2O2，３７ ℃温育６０ ｍｉｎ，在波长５３６ ｎｍ处测定吸光度值，同时用1 ｍＬ的去离子水代替样品液，作为损伤管；用 1 ｍＬ的去离子水代替Ｈ２Ｏ２，作为空白管。每个处理试样均做３个平行，取平均值。通过以下公式计算出不同维生素Ｃ浓度的・ＯＨ清除率，并绘制标准曲线。
　　・ＯＨ清除率＝×１００％
　　１．２．２超氧阴离子的清除试验根据吴慧平的方法［８］，邻苯三酚在碱性条件下能发生自氧化，生成有色中间物（在４２０ ｎｍ处有最大吸收峰）和超氧阴离子（・Ｏ２－），超氧阴离子对自氧化又起催化作用，依据有色中间物生成量的多少，可判断超氧阴离子生成量的多少［９］。具体测定方法是在１０ ｍＬ的比色管中分别加入４ ｍＬ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ缓冲液（ｐＨ值８．２），置于２５ ℃水浴中预热２０ ｍｉｎ，然后分别加入２０、４０、６０、８０、１００ μｇ/ｍＬ的样品液或维生素Ｃ溶液1 ｍＬ，再加入在２５ ℃预热２０ ｍｉｎ的1 ｍＬ ０．２ ｍｍｏｌ／Ｌ邻苯三酚溶液（邻苯三酚用０．０５ ｍｏｌ／Ｌ的ＨＣｌ配制），混匀后在２５℃水浴中反应４ ｍｉｎ，立即用２滴８ ｍｏｌ／Ｌ的ＨＣｌ终止反应， 并在波长４２０ ｎｍ处测定吸光度值，以等体积１０ ｍｍｏｌ／Ｌ的ＨＣｌ代替邻苯三酚溶液为空白，调零；对照组为1 ｍＬ的维生素Ｃ溶液。每个处理试样均做３个平行试验， 取平均值，其中维生素Ｃ为阳性对照。按下式计算・Ｏ２－清除率［６］，并绘制标准曲线。
　　・Ｏ２－清除率＝×１００％
　　１．２．３火炭母有效成分的提取称取火炭母粉末４０ ｇ，分别加入６００ ｍＬ甲醇，在２００ Ｗ超声波细胞破碎机里处理４０ ｍｉｎ后回流提取２ ｈ，所得提取物经过脱色、过滤得提取液，并蒸发浓缩至５０ ｍＬ，从中取出1 ｍＬ，稀释一定倍数，利用Ｈ２Ｏ２/Ｆｅ２＋体系法测定其对羟自由基的清除作用，或者利用邻苯三酚体系法测定其对超氧阴离子的清除作用，计算出清除率，并与维生素Ｃ标准曲线比较，计算出稀释液中与维生素Ｃ相当的浓度，再根据稀释倍数计算得出总提取液中与维生素Ｃ相当的物质含量。
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　　１∶２、１∶１、２∶１、５∶１、１∶０。
　　２结果与分析
　　２．１维生素Ｃ对・ＯＨ清除率的标准曲线
　　根据测定结果绘制维生素Ｃ对・ＯＨ清除率的标准曲线，结果见图１，从图１可见，清除率与维生素Ｃ浓度有很好的线性关系，相关系数为０．９９８ ４。
　　２．２维生素Ｃ对・Ｏ２－清除率的标准曲线
　　由测定结果绘制维生素Ｃ对・Ｏ２－清除率的标准曲线，结果维生素Ｃ浓度在０～１００ μｇ／ｍＬ 范围内，与清除率有良好的线性关系，其线性方程为ｙ＝０．００２ １ｘ＋０．００３ ５，相关系数为０．９９１ １，可以作为标准曲线对火炭母提取液中的抗氧化效果进行测定。
　　２．３条件优化
　　２．３．１提取方法对火炭母有效成分提取效果的影响试验考察了直接浸泡、微波辅助浸泡、超声波辅助浸泡３种方法对火炭母有效成分提取效果的影响，结果见表１，由表１可知，在超声波辅助的前提下，提取液对・ＯＨ－的清除率较其他两种方法要高。
　　２．３．２超声波时间对火炭母有效成分提取效果的影响在超声波功率设置为２００ Ｗ的前提下，分别进行超声波处理２０、４０、６０、８０ ｍｉｎ，以比较超声波时间对火炭母有效成分提取效果的影响，结果见表２，从表２结果可见，当超声波处理时间为４０ ｍｉｎ时，对火炭母有效成分提取的效果最佳。
　　２．３．３溶剂种类对火炭母有效成分提取效果的影响试验分别用甲醇、水、乙酸乙酯和石油醚４种溶剂对火炭母有效成分进行了提取，比较它们的提取液对・ＯＨ－的清除情况，结果见表３。从表３可见，火炭母甲醇提取液对・ＯＨ－的清除率最高，是提取火炭母抗氧化有效成分的理想溶剂。
　　２．３．４甲醇浓度对火炭母有效成分提取效果的影响甲醇浓度（甲醇∶水，体积比）对火炭母有效成分提取效果影响的测定结果见表４，由表４可知，不同浓度甲醇对提取液的抗氧化性能影响较大，当甲醇∶水为１∶１时，提取液对・ＯＨ－的清除效果最好。
　　２．４提取液对超氧阴离子的清除率
　　综合前述优化条件，采用超声波处理４０ ｍｉｎ、甲醇∶水为１∶１、提取液体积为６００ ｍＬ、回流２ ｈ时的火炭母提取液，对・Ｏ２－进行清除率测定，结果见表５，由表５可知，火炭母提取液对・Ｏ２－有较强的清除作用，通过计算得出当火炭母原料为４０ ｇ、提取液浓缩至５０ ｍＬ时，总提取液对超氧阴离子的清除效果与９．８２ ｇ维生素Ｃ的效果相当。
　　３小结与讨论
　　试验采用超声波辅助手段方法对火炭母中抗氧化成分进行了提取，用Ｈ２Ｏ２/Ｆｅ２＋体系法和邻苯三酚体系法对提取液中的有效成分进行了测定，所得结果显示，火炭母甲醇提取液具有较强的抗氧化作用，可以为火炭母制剂临床用药及保健用药提供参考。
　　参考文献：
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　　［２］ 徐国钧，何宏贤． 中国药材学（下册）［Ｍ］． 北京： 中国医药科技出版社，１９９６．１３７１．
　　［３］ 谢贤强，吴萍，林立东，等． 火炭母化学成分的研究［Ｊ］． 热带亚热带植物学报，２００７，１５（５）：４５０－４５４．
　　［４］ 朱华，高雅，张可锋，等． 不同产地火炭母中槲皮素的含量测定方法研究［Ｊ］． 中药新药与临床药理，２００９，２０（６）：５５７－５５９．
　　［５］ 梁清涛，李琦，张宗德，等． 肺结核患者氧化／抗氧化失衡的初步研究［Ｊ］． 结核病与胸部肿瘤，２００８（１）：２５－２９．
　　［６］ 修晓娜，史远刚，关伟军，等． 自由基与人类衰老［Ｊ］． 中华现代中医学杂志，２００８，４（２）： １０８－１１２．
　　［７］ 徐振华，刘忠玲． 自由基清除剂及其对延缓衰老的影响［Ｊ］． 中外医学研究，２０１０，８（５）：７７－７８．
　　［８］ 吴慧平． 当归不同炮制品清除自由基和抗脂质过氧化作用［Ｊ］． 中国中药杂志，１９９６，２１（１０）： ５９９．
　　［９］ 宋琳琳，冉军舰，张晓娜． 金银花中总黄酮抗氧化性的研究［Ｊ］． 现代农业科学，２００９，９（１６）：１－２．
　　注：本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文
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