L-苏氨酸发酵种子培养基及培养条件的优化|L-15培养基

　　摘要：采用正交试验设计对菌株ＷＳ４００６－７Ｅ－ＮＵＴ－２１ Ｌ－苏氨酸发酵的种子培养基进行优化，同时对影响种子生长的条件如种子培养时间、种子液初始ｐＨ值、种子装液量等进行了研究，最终确定了Ｌ－苏氨酸发酵的最优种子培养条件。确定了种子培养基的最佳组成为葡萄糖３０ ｇ／Ｌ、硫酸铵３ ｇ／Ｌ、玉米浆４０ ｇ／Ｌ、酵母膏５ ｇ／Ｌ；种子的最佳培养条件为２５０ ｍＬ的三角瓶中装液量２５ ｍＬ，种子培养基的初始ｐＨ值７．０，培养时间１６ ｈ，接种量１０％。
　　关键词：Ｌ－苏氨酸；发酵；种子培养基；培养条件；优化
　　中图分类号：ＴＱ４６４．７文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０11）13－2730-03
　　
　　Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｅｅｄ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｕｍ ａｎｄ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｌ－ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ
　　
　　ＬＩＵ Ｋｅ－ｋｅ１，ＺＨＡＮＧ Ｌｉ２，ＨＡＮ Ｘｉａｎｇ－ｍｉｎ１， ＺＨＡＮＧ Ｊｕｎ－ｓｈｅｎｇ２，ＹＡＮＧ Ｘｉａｏ－ｚｈｉ２
　　（１． Faculty of Animal Science & Technology，Ｇａｎｓｕ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｌａｎｚｈｏｕ ７３００７０， Ｃｈｉｎａ；
　　２． Ｊｉａｎｇｓｕ Ｖｏｃａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｈｕｓｂａｎｄｒｙ ａｎｄ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ， Ｔａｉｚｈｏｕ ２２５３００， Ｊｉａｎｇｓｕ， Ｃｈｉｎａ）
　　
　　Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｅ ｓｅｅｄ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍ ｏｆ Ｌ－threonine ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｓｔｒａｉｎ ＷＳ４００６－７Ｅ－ＮＵＴ－２１ ｗａｓ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｂｙ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｄｅｓｉｇｎ． Ｍｅａｎｗｈｉｌｅ， ｔｈｅ ｆａｃｔｏｒｓ ｔｈａｔ ｍｉｇｈｔ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ ｓｅｅｄｓ ｓｕｃｈ ａｓ ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ， ｐＨ， ａｎｄ ｃｕｌｔｕｒｅ ｖｏｌｕｍｅ ｗｅｒｅ ｓｔｕｄｉｅｄ； ａｎｄ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｕｍ ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ ｗａｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ． Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｍｅｄｉｕｍ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ｗａｓ ３０ ｇ／Ｌ ｇｌｕｃｏｓｅ， ３ ｇ／Ｌ ａｍｍｏｎｉｕｍ ｓｕｌｆａｔｅ， ４０ ｇ／Ｌ ｃｏｒｎ ｓｔｅｅｐ ａｎｄ ５ ｇ／Ｌ ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ． Ｗｈｉｌｅ ｔｈｅ ｂｅｓｔ ｓｅｅｄ ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｗｅｒｅ ｃｕｌｔｉｖａｔｉｎｇ ２５ ｍＬ ｌｉｑｕｉｄ ｓｅｅｄ ｉｎ ２５０ ｍＬ ｏｆ ｆｌａｓｋ， ｏｒｉｇｉｎａｔｅ ｐＨ ７．０， ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ １６ ｈ ａｎｄ ｗｉｔｈ ａｎ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ ａｍｏｕｎｔ ｏｆ １０％．
　　Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｌ－ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ； ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ； seed culture medium； culture conditions； ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ
　　
　　Ｌ－苏氨酸是一种必需氨基酸，被广泛应用于生产食品、医药、饲料添加剂等［１］。近年来，随着人民生活水平的提高和养殖业的迅速发展，苏氨酸的需求量大增，但是受技术限制，国内苏氨酸的产量较小，生产工艺和产品质量均不成熟，绝大部分的需求依赖进口［２］。目前，微生物发酵法以其生产成本低、节约资源、环境污染小等优点成为工业化生产苏氨酸的主要方式。微生物发酵种子培养的目的是在较短的时间内获得大量健壮活跃的种子，为后续发酵产物的形成打下坚实的基础，若种子质量异常，会给发酵造成极大的影响［３］。而获得优良种子的主要因素包括选用合适的种子培养基及良好的种子培养条件。对Ｌ－苏氨酸生产菌ＷＳ４００６－７Ｅ－ＮＵＴ－２１的种子培养基及部分培养条件进行了研究，旨在为Ｌ－苏氨酸的工业化生产提供理论依据。
　　１材料与方法
　　１．１材料
　　１．１．１菌株Ｌ－苏氨酸产生菌ＷＳ４００６－７Ｅ－ＮＵＴ－２１为从江苏畜牧兽医职业技术学院生物技术实验室保存的菌株ＷＳ４００６中分离诱变选育得到的菌株，初步鉴定为嗜麦芽寡养单胞菌（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ）。
　　１．１．２培养基［４］基础种子培养基：葡萄糖４０ ｇ／Ｌ，硫酸铵４ ｇ／Ｌ，玉米浆３０ ｇ／Ｌ，酵母膏５ ｇ／Ｌ，Ｋ２ＨＰO４ １ ｇ／Ｌ，ＫＨ２Ｐ０４ １ ｇ／Ｌ，ＭｇＳ０４・７Ｈ２０ ０．２５ ｇ／Ｌ，Ｆｅ２ＳO４・７Ｈ２O ０．０１ ｇ／Ｌ，ＭｎＳO４・Ｈ２Ｏ ０．０１ ｇ／Ｌ，ｐＨ ７．０，１１５ ℃灭菌１５ ｍｉｎ。发酵培养基：蔗糖 １００ ｇ／Ｌ，硫酸铵 ２０ ｇ／Ｌ，Ｋ２ＨＰO４ ０．５ ｇ／Ｌ，ＫＨ２ＰO４ ０．５ ｇ／Ｌ，ＭｇＳO４・７Ｈ２Ｏ ０．２５ ｇ／Ｌ，玉米浆 ２０ ｇ／Ｌ，Ｆｅ２ＳO４・７Ｈ２Ｏ ０．０１ ｇ／Ｌ，
　　１．２方法
　　１．２．１种子培养及苏氨酸发酵①菌体斜面活化：取保藏培养基上保藏的菌种，挑少许菌落接种到制备好的活化培养基斜面上，３０ ℃培养４８ ｈ，使菌株达到最佳生长状态。②种子培养：在装有２５ ｍＬ种子培养基的２５０ ｍＬ摇瓶中，接种一环新鲜的活化种子，８层纱布封口，于全温振荡器上３０ ℃、１８０ ｒ／ｍｉｎ振荡培养１４ ｈ。③发酵培养：在装有２５ ｍＬ发酵培养基的２５０ ｍＬ摇瓶中，以１０％的接种量接种种子培养液，８层纱布封口，置全温振荡器上３０ ℃、１８０ ｒ／ｍｉｎ振荡培养７２ ｈ。④用ｐＨ ６．４～８．０的精密ｐＨ试纸测定ｐＨ值。⑤Ｌ－苏氨酸产量的测定采用纸层析法［５］。
　　１．２．２正交试验优化种子培养基成分种子培养基的组成不同，会导致培养基中的微量元素和其他营养成分含量发生变化，对菌体生长和产物形成的影响很大。选取种子培养基的主要成分葡萄糖（Ａ）、玉米浆（Ｂ）、硫酸铵（Ｃ）、酵母膏（Ｄ）４个因素，每个因素选取３个浓度水平，进行Ｌ９（３４）正交试验，优化种子培养基，每个试验组两次重复，各因素及水平见表１。
　　１．２．３单因素试验优化培养条件设置单因素试验，分别考察种子培养基装液量、种子接种量、初始ｐＨ值和种龄对菌株产Ｌ－苏氨酸产量的影响。①种子培养基装液量：分别取一环新鲜的活化菌种至装有１５、２０、２５、３０、３５ ｍＬ种子培养基的２５０ ｍＬ三角瓶中，于３０ ℃、１８０ ｒ／ｍｉｎ振荡培养１６ ｈ后，转入发酵培养基中摇瓶发酵７２ ｈ后测定Ｌ－苏氨酸的产量；②种子接种量：将活化菌种接种到试验①所得的最优种子培养基装液量下培养１６ ｈ后，分别以６％、８％、１０％、１２％、１４％的接种量接入发酵培养基中发酵７２ ｈ后测定Ｌ－苏氨酸的产量；③种子液初始ｐＨ值：按照①、②优化后的培养条件，将活化的菌种接种到ｐＨ值分别为６．４、６．７、７．０、７．２、７．５、７．７的种子培养基中培养１６ ｈ后，接入发酵培养基中培养７２ ｈ后测定Ｌ－苏氨酸的产量。④种龄：取一环新鲜的活化菌种，接种于装有５０ ｍＬ种子培养基的２５０ ｍＬ三角瓶中，振荡培养，每隔２ ｈ取样０．５ ｍＬ，用无菌水稀释１０倍后，用７２２型紫外分光光度计测定吸光度（ＯＤ５０８nm），以时间为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制种子生长曲线；取一环新鲜的活化菌种，按照①～③所得的条件对活化的菌种进行培养，６～２２ ｈ期间每隔２ ｈ取种子液接种到发酵培养基中，３０ ℃、１８０ ｒ／ｍｉｎ振荡培养７２ ｈ后测定Ｌ－苏氨酸的产量。
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　　２．１种子培养基的优化
　　从表２中极差Ｒ的大小可知，各因素对产酸的影响顺序依次是硫酸铵、玉米浆、酵母膏、葡萄糖。硫酸铵是无机氮源，其能被菌体快速利用，以满足菌体生长繁殖及产物合成的需要，对种子培养基及产物形成的影响最大；玉米浆是制造玉米淀粉的副产物，含有丰富的蛋白质以及其他一些生长因子，在种子培养基中既能够补充氮源还能提供微生物生长所需的多种营养物质，所以对产物合成影响也较大；酵母膏富含蛋白质、核苷酸、维生素及微量元素等微生物生长所必需的生长元素，对产物的形成有一定的影响；葡萄糖对产物影响最小，在种子培养基中不宜多加，因为高浓度的糖类不仅不能维持菌体生长，反而会起到抑菌或杀菌的作用。
　　４个因素的最优水平组合为Ａ１Ｂ３Ｃ１Ｄ２，即葡萄糖３０ ｇ／Ｌ，玉米浆４０ ｇ／Ｌ，硫酸铵３ ｇ／Ｌ，酵母膏５ ｇ／Ｌ。由于正交实验所确定的最佳条件并未包含在正交表的９个试验中，为了进一步确定试验结果的可重复性，采用最佳条件进行重复实验。由表３可知，按照最佳种子培养基的配方所得的平均产酸量为５．７８ ｇ／Ｌ，试验结果较为理想。
　　２．２种子培养条件的优化
　　２．２．１种子培养基装液量对发酵产酸的影响Ｌ－苏氨酸发酵属于好氧发酵，溶解氧对苏氨酸发酵的影响较大，发酵过程应控制通风，以满足菌体生长和产酸的需要。在一定温度下溶氧是装液比（培养基装液量／三角瓶体积）和摇瓶转速的函数［７］，如果摇瓶转速固定则装液比就会直接影响到培养基的溶氧情况。本试验采用固定摇床转速，考察同一规格三角瓶在不同装液量情况下菌体的发酵产酸水平。根据试验结果（图１），不同的种子培养基装液量对发酵产酸量的影响比较明显，在２５０ ｍＬ三角瓶中装２５ ｍＬ的种子培养基，发酵产酸量最大。
　　２．２．２种子接种量对发酵产酸的影响由图２可知，接种量过大或者过小均不利于产酸。大量地接入菌种，缩短了发酵周期，但是会造成培养基中溶氧过少，影响发酵产物形成；接种量过少，培养基中菌体浓度小，也不利于产物形成，当种子液的接种量为１０％时，发酵产酸量最大。
　　２．２．３种子液初始ｐＨ值对发酵产酸的影响分析图３可知，种子培养基过酸或过碱，均不利于产物的形成，当种子液的初始ｐＨ值为７．０时，发酵产酸量最大。分析原因可能是因为ｐＨ值的变化会引起各种酶活力的改变，从而对菌体生长和代谢能力产生影响［８］。
　　２．２．４种龄对发酵产酸的影响一般地，接种的种龄以对数生长期的后期，即培养液中菌浓度接近高峰时较为适宜。种龄短的种子接种后往往会导致前期生长缓慢，整个发酵周期延长，产物开始形成时间推迟。过老的种子虽然菌量较多，但接种后会导致生产能力下降，菌体过早衰退［６］。从种子生长曲线（图４）可以看出，菌体从４ ｈ开始进入对数期，１８ ｈ以后进入稳定期，因此，种子培养时间不宜超过１８ ｈ。
　　从图５可以看出，随着种子培养时间的延长，发酵产酸量先逐渐提高，到１６ ｈ达到最高产酸量，１６ ｈ以后发酵产酸量逐渐减低。结合种子生长曲线，在１６ ｈ刚好处于种子生长的中后期，这时的菌体数量最多，种子生长最为旺盛，接种这时期的种子发酵产酸量最多。
　　３结论
　　本试验应用正交设计，确定了种子培养基的最佳组成为：葡萄糖３０ ｇ／Ｌ，硫酸铵３ ｇ／Ｌ，玉米浆４０ ｇ／Ｌ，酵母膏５ ｇ／Ｌ；用单因素试验设计，确定了种子的最佳培养条件：２５０ ｍＬ的三角瓶中装液量２５ ｍＬ，种子培养基的初始ｐＨ值７．０，接种量１０％，培养时间１６ ｈ。本研究为进一步了解菌种ＷＳ４００６－７Ｅ－ＮＵＴ－２１的特性以及提高Ｌ－苏氨酸的产量提供了参考依据，为苏氨酸发酵的工业化生产奠定了一定的基础。
　　
　　参考文献：
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　　［３］ 石天虹，刘雪兰，刘辉，等．微生物发酵的影响因素及其控制［Ｊ］． 家禽科学，２００５（２）：４５－４８．
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　　［５］ 解晓鹏．Ｌ－苏氨酸高产菌的选育［Ｄ］．兰州：甘肃农业大学，２００９．
　　［６］ 储炬，李友荣． 现代工业发酵调控学［Ｍ］． 北京：化学工业出版社，２００２．２６２．
　　［７］ 陈俊峰． Ｌ－色氨酸高产菌的选育及其发酵条件的优化［Ｄ］．西安：西北大学，２００７．
　　［８］ 白秀峰． 发酵工艺学［Ｍ］． 北京：中国医药科技出版社，２００３．９７．
　　
　　注：本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文
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