猪传染性胸膜肺炎的实验室诊断|猪胸膜肺炎的症状图片

　　摘要：采用生化试验、间接血凝试验对送检的疑似猪传染性胸膜肺炎病猪的病料及血清进行诊断和药敏试验。结果表明，从病猪肺脏中分离到１株疑似胸膜肺炎放线杆菌，其革兰氏染色为阴性球杆菌，在普通营养琼脂和麦康凯培养基上不能生长，在ＴＳＡ平板上形成不透明的淡灰色、湿润、光滑、表面隆起的菌落，血凝试验为阳性，确定所分离菌为胸膜肺炎放线杆菌。同时对该猪群随机抽检１２份血样，用猪胸膜肺炎间接血凝试剂盒检测胸膜肺炎抗体，其阳性率为８．３％。药敏试验表明，磺胺间甲氧嘧啶钠和长效痢清为敏感药物。
　　关键词：猪胸膜肺炎放线杆菌；细菌分离鉴定；血凝试验；药敏试验
　　中图分类号：Ｓ８５８．２８文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０11）13－2694-02
　　
　　Ｔｈｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ Ｐｏｒｃｉｎｅ Ｃｏｎｔａｇｉｏｕｓ Ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａ
　　
　　ＦAN Ｇｕｏ－ｙｉｎｇ１，ＺHU Ｚｈｏｎｇ－ｋｅ２，ＺHONG Ｈｕａ１，ＣHEN Ｊｕｎ－ｊｉｅ１
　　（1. Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｈｅｎａｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｘｉｎｘｉａｎｇ， ４５３００３，Ｈｅｎａｎ，Ｃｈｉｎａ；
　　2. Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｏｒｅｓｔ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ， Ｈｕａｎｇｈｕａｉ Iｎｓｔｉｔｕｔｅ， Ｚｈｕｍａｄｉａｎ， ４６３０００， Ｈｅｎａｎ，Ｃｈｉｎａ）
　　
　　Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｅ ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｔｅｓｔ ａｎｄ ｉｎｄｉｒｅｃｔ ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ ｔｅｓｔ ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ｔｏ ｃｈｅｃｋ ｔｈｅ ｓａｍｐｌｅｓ ａｎｄ ｓｅｒｕｍ ｏｆ ｐｉｇｓ ｓｕｓｐｅｃｔｅｄ as ｐｏｒｃｉｎｅ ｃｏｎｔａｇｉｏｕｓ ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａ （ＰＣＰ） Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ａ ｓｕｓｐｅｃｔｅｄ Aｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ｗａｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｐｉｇ ｌｕｎｇ. Ｉｔ ｗａｓ Ｇｒａｍ ｓｔａｉｎｉｎｇ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｃｃｏｂａｃｉｌｌｕｓ， ａｎｄ ｃｏｕｌｄ ｎｏｔ ｇｒｏｗ ｉｎ ｏｒｄｉｎａｒｙ ｎｕｔｒｉｅｎｔ ａｇａｒ ａｎｄ ＭｃＣｏｎｋｅｙ＇ｓ ａｇａｒ． Ｉｔ ｃｏｕｌｄ ｇｒｏｗ ａｎｄ ｆｏｒｍ ａ ｏｐａｑｕｅ ｏｃｅａｎ ｇｒｅｙ， ｍｏｉｓｔ， ｓｍｏｏｔｈ ｃｏｎｏｌｙ ｗｉｔｈ ｕｐｈｅａｖａｌ ａｔ ｓｕｒｆａｃｅ ｉｎ ＴＳＡ ｐｌａｔｅ； ａｎｄ ｔｈｅ ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ ｔｅｓｔ ｗａｓ ｐｏｓｉｔｉｖｅ． Ｉｔ ｗａｓ confirmed ｔｈａｔ ｔｈｅ ｉｓｏｌａｔｅｄ bacterium ｗａｓ Aｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ． １２ ｂｌｏｏｄ ｓａｍｐｌｅｓ ｗｅｒｅ randomly ｓｅｌｅｃｔｅｄ ａｎｄ ｅｘａｍｉｎｅｄ ｂｙ ＰＣＰ ｉｎｄｉｒｅｃｔ ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ ｋｉｔ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｒａｔｉｏ ｏｆ ＰＣＰ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｗａｓ ８．３％． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔ ｏｆ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ ｔｅｓｔ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｓｕｌｆａｍｏｎｏｍｅｔｈｏｘｉｎｅ ｓｏｄｉｕｍ ａｎｄ ｌｏｎｇ－ａｃｔｅｄ Ｌｉｑｉｎｇ ｗｅｒｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｄｒｕｇｓ．
　　Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Aｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ； ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａ； ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ ｔｅｓｔ； ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ ｔｅｓｔ
　　
　　猪传染性胸膜肺炎（Porcine contagious pleuropneumonia，ＰＣＰ）是由胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae，ＡＰＰ）引起的一种高度传染性的呼吸系统疾病。该病以急性出血和慢性纤维素性胸膜肺炎为特征，具有较高的发病率和致死率［１］。随着集约化养猪业的迅猛发展，国家及地区间引种频繁，导致该病的发病率及死亡率大大提高，耐药性问题导致的治疗失败，给世界各地的养猪业带来了极大的经济损失［２，３］。
　　本试验对河南省新乡市某猪场的发病猪病料进行了细菌分离鉴定、血清学检测及药敏试验，旨在为该病的诊断与治疗提供科学依据。
　　１材料与方法
　　１．１材料
　　１．１．１试剂麦康凯琼脂培养基、普通营养琼脂培养基、羊鲜血琼脂平板、巧克力琼脂平板、胰蛋白胨大豆琼脂培养基（ＴＳＡ）、草酸铵结晶紫、革兰氏碘液、石碳酸复红染液由河南科技学院临床兽医学教研室提供；ＡＰＰ间接血凝抗原、标准阳性血清、标准阴性血清、稀释液由中国农业科学院兰州兽医研究所提供；金黄色葡萄球菌由河南科技学院预防兽医教研室提供；药敏试验所用药物均由河南科技学院兽医院提供。
　　１．１．２仪器ＨＨ．Ｂ１１恒温培养箱（厦门建红医疗器械厂），７５－２型微量振荡器（江苏金坛设备有限公司），ＯＬＹＭＰＵＳ―ＣＨ显微镜（Ｊａｐａｎ），ＨＧ１０１－２Ａ电热鼓风干燥箱（南京实验仪器厂）。
　　１．１．３病料河南新乡市某猪场送检的疑似病猪病料１０份及病猪血清２份。
　　１．２方法
　　１．２．１细菌的分离与培养对病死猪进行病理剖检，观察各个器官的病变。无菌采取疑似ＰＣＰ病变肺组织，在ＴＳＡ培养基上接种培养，观察菌落生长情况，挑取可疑菌落涂片、革兰氏染色、镜检［４］。
　　１．２．２生化培养特性鉴定将分离到的可疑菌落，分别接种于加入０．０１％ ＮＡＤ的羊鲜血琼脂平板、巧克力琼脂平板、麦康凯琼脂平板、普通营养琼脂平板，于３７ ℃培养２４ ｈ，观察菌落在各个培养基的生长情况。将可疑菌平行接种布满整个不含Ｖ因子的普通营养琼脂培养基，再在其上垂直划线接种２条金黄色葡萄球菌，３７ ℃培养２４ ｈ，观察卫星现象。无菌状态下，用接种针取分离菌纯培养物，分别接种于加有０．０１％ＮＡＤ的生化反应管中，置于培养箱中３７ ℃培养２４ ｈ，观察其生化特性。
　　１．２．３间接血凝试验１２份抽检血清和被检血样的处理：将送检病猪的血样静置，析出血清，在使用前置于５６ ℃水浴锅中灭能３０ ｍｉｎ，４ ℃保存待检。
　　ＡＰＰ间接血凝抗原的处理：用灭菌生理盐水１０ ｍＬ稀释摇匀，１ ５００ ｒ／ｍｉｎ离心１０ ｍｉｎ，弃上清液，加等量的稀释液摇匀，置４ ℃冰箱２４ ｈ后使用。将冻干标准阳性血清和标准阴性血清按试剂盒说明使用，混匀后作对照。具体操作步骤参见文献［５］。
　　判定标准：“＋＋＋＋”表示１００％血球凝集，红细胞全部凝集，形成一层均匀的膜，布满整个孔底；“＋＋＋”表示７５％血球凝集，红细胞在孔底形成一层薄膜，但面积比前者小；“＋＋”表示５０％血球凝集，红细胞在孔底形成薄膜凝集，边缘松散或呈锯齿状；“＋”表示２５％血球凝集，红细胞在孔底呈稀薄散在少量凝集，孔底有小圆点；“－”表示不凝集，红细胞全部沉于孔底，边缘光滑。以出现５０％红细胞凝集的最高稀释倍数判定为该血清的凝集价（效价）［６］。
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　　待检血清的判定标准：检测血清抗体效价≥１∶８判为阳性，效价≤１∶４为阴性。
　　１．２．４药敏试验将分离菌在巧克力琼脂平板上均匀划线接种，按常规纸片法将药敏纸片贴在平板上，置于恒温培养箱２４ ｈ，观察并测量抑菌圈的大小，判定不同药物的敏感程度。判定标准：抑菌圈直径≥２０ ｍｍ为高度敏感（＋＋＋），直径１０～２０ ｍｍ为中度敏感（＋＋），直径≤１０ ｍｍ为低度敏感（＋），无抑菌圈为不敏感（－）［７］。
　　２结果与分析
　　２．１细菌的分离与培养
　　在ＴＳＡ平板上形成不透明、淡灰色、湿润、光滑、表面隆起的菌落，挑取单个可疑菌落镜检观察，有革兰氏染色呈阴性的小球杆菌。病理剖检结果：剖检病猪可见其肺脏表面有纤维素性物质附着，并与胸壁和膈肌粘连，胸腔有黄色积液，心包外膜附着有纤维素性物质，心包积液，颌下淋巴结肿大，肝脏和肾脏未见异常。
　　２．２生化培养结果
　　分离菌株在巧克力琼脂平板上３７ ℃培养２４ ｈ后，形成湿润、浅灰色隆起、直径０．５～０．８ ｍｍ的圆形菌落；在麦康凯和普通营养琼脂平板上不生长；在羊鲜血琼脂平板上有溶血现象。
　　在靠近金黄色葡萄球菌的地方，可疑菌生长较多，远离划线处则生长较少，表明其对Ｖ因子有依赖性。该菌能发酵葡萄糖、甘露糖、蔗糖、果糖，不能发酵甘露醇，尿素酶试验呈阳性，产生硫化氢气体，靛基质试验呈阴性。
　　综合以上试验结果，可确定该分离菌为胸膜肺炎放线杆菌。
　　２．３血清学诊断结果
　　血清学诊断结果表明，被检病猪的血清抗体效价均大于１∶８，可确定为阳性。抽检的１２份猪血样中，血凝效价在１∶８以上的有１份，在１∶８以下的有１１份，其阳性率为8.3%。
　　２．４药敏试验结果
　　药敏试验结果见表１。由表１可以看出，该菌对磺胺间甲氧嘧啶钠高敏，对长效痢清中敏，对强效头孢、头孢噻呋、青霉素钾、氨苄青霉素、氟苯尼考、阿莫西林等不敏感。
　　３讨论
　　引起猪呼吸系统疾病的病原较多，有些胸膜肺炎病原还能激发或伴发其他疾病如巴氏杆菌、副猪嗜血杆菌、猪放线杆菌的感染［５］。该病的临床症状缺乏特征性，仅靠纤维素性胸膜炎、胸肺粘连等病变不能准确诊断，ＰＣＰ病例并不一定都表现为纤维素性胸膜肺炎，有的表现为肺部充血、水肿［８］。因此对猪传染性胸膜肺炎的确诊必须依靠恰当的实验室诊断技术。ＡＰＰ在生长过程中对营养及环境要求较高。ＴＳＡ培养基营养丰富，对于嗜血菌的培养率非常高，现引入到ＡＰＰ的分离培养中，效果很好。同时，因该菌与其他杂菌混合感染的时候，细菌的分离更加困难，建议选取未经用药的病猪或濒死猪进行分离，其分离率较高，分离时应严格无菌操作，防止杂菌的污染。
　　本试验采用血凝试剂盒进行检测，结果病死猪的ＰＣＰ抗体效价均在１∶８以上，该猪群未进行过免疫，说明该猪群感染了ＡＰＰ。加上各地流行病株的血清型各有差异，没有通用疫苗进行免疫，目前多数猪场仍以药物控制作为预防和治疗的主要手段，但ＡＰＰ易产生耐药性，且部分敏感猪在感染后短时间内发生不可逆转的肺组织病变，因此猪场兽医应对ＡＰＰ的感染情况有充分的认识，必要时可定期分离病原进行体外药敏试验，以便早期进行预防［９］。
　　
　　参考文献：
　　［１］ 吴家强，崔锦鹏， 张秀美， 等． 猪接触传染性胸膜肺炎研究进展［Ｊ］． 畜牧与兽医，２００２，３４（１０）：３６－３９．
　　［２］ 张立昌．猪传染性胸膜肺炎研究进展［Ｊ］． 养猪，２００１（１）：４０－４２．
　　［３］ 陈海平，蔡金洲，张辉，等． 猪嗜血杆菌胸膜肺炎的流行和防制［Ｊ］．养猪，１９９５（１）：３４．
　　［４］ 陈小玲，杨旭夫，朱士盛．猪传染性胸膜肺炎的流行现状和防制措施［Ｊ］．中国兽医杂志，２００１，３７（７）：３３－３５．
　　［５］ 姚火春．兽医微生物实验指导［Ｍ］．北京：中国农业出版社，２００１． ３０－５０．
　　［６］ 刘慧芳，刘江梅，余旭平．猪传染性胸膜肺炎鉴别诊断方法［Ｊ］．上海畜牧兽医通讯，２００６，２５（５）：５２－５３．
　　［７］ 蔡宝祥．家畜传染病学（第三版）［Ｍ］．北京：中国农业出版社，１９９６．１４４－１４５．
　　［８］ 陆承平．兽医微生物学（第三版）［Ｍ］．北京：中国农业出版社，２００１．
　　［９］ 王天有，刘保国，赵恒章．猪传染病现代诊断与防治技术［Ｍ］．北京：中国农业科学技术出版社，２００５．４０－１７９．
　　
　　注：本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文
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