[dtsR1基因缺失对谷氨酸发酵的影响] 基因缺失
摘要：利用基因敲除的方法将野生型谷氨酸棒状杆菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）定向缺失ｄｔｓＲ１基因，构建△ｄｔｓＲ１突变菌株，分析其在无诱导条件、添加吐温-４０及生物素限制条件下菌体的生长和谷氨酸生产情况，并与野生型谷氨酸棒状杆菌在相同的发酵条件下进行比较。结果发现，在无诱导条件下，△ｄｔｓＲ１突变菌株能够引发谷氨酸的合成，而野生型谷氨酸棒状杆菌不分泌谷氨酸。在添加吐温-４０及生物素限制条件下，△ｄｔｓＲ１突变菌株的谷氨酸产量明显高于无诱导条件下的谷氨酸产量。ｄｔｓＲ１基因的缺失提高了菌株的生长与谷氨酸合成的能力，在无诱导条件下也能促使谷氨酸的合成。
关键词：谷氨酸棒状杆菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）；ｄｔｓＲ１基因；谷氨酸发酵
中图分类号：Ｑ９３６ 文献标识码：Ａ 文章编号：0439－８114（２０12）16－3584-03
Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｄｔｓＲ１ Ｇｅｎｅ Ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｏｎ ｔｈｅ Ｇｌｕｔａｍａｔｅ Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ
ＫＯＮＧ Ｊｉｎｇ
（Ｆａｃｕｌｔｙ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｈｕａｉｙｉｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｈｕａｉａｎ ２２３００３，Ｊｉａｎｇｓｕ，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｗｉｌｄ－ｔｙｐｅ Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ｓｔｒａｉｎ ｗａｓ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ａｎｄ ｋｎｏｃｋｅｄ ｄｔｓＲ１ ｇｅｎｅ． Ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｇｌｕｔａｍａｔｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ △ｄｔｓＲ１ ｍｕｔａｎｔ ａｎｄ ｗｉｌｄ－ｔｙｐｅ ｓｔｒａｉｎ ｗｅｒｅ ａｎａｌｙｚｅｄ ｂｙ ｇｌｕｔａｍａｔｅ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｕｎｄｅｒ ｎｏｎ－ｉｎｄｕｃｉｎｇ， ａｄｄｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｗｅｅｎ－４０ ｏｒ ｂｉｏｔｉｎ ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ． Ｄａｔａ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｇｌｕｔａｍａｔｅ synthetized ｗａｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ △ｄｔｓＲ１ ｍｕｔａｎｔ ｕｎｄｅｒ ｎｏｎ－ｉｎｄｕｃｉｎｇ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ； ｈｏｗｅｖｅｒ， ｗｉｌｄ－ｔｙｐｅ ｓｔｒａｉｎ ｄｉｄ ｎｏｔ ｓｅｃｒｅｔ ｇｌｕｔａｍａｔｅ ａｔ ａｌｌ． Ｔｈｅ ａｍｏｕｎｔ ｏｆ ｇｌｕｔａｍａｔｅ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ ｔｈｅ △ｄｔｓＲ１ ｍｕｔａｎｔ ｗａｓ ｍｕｃｈ ｍｏｒｅ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｏｆ ｗｉｌｄ－ｔｙｐｅ ｓｔｒａｉｎ ｕｎｄｅｒ ａｄｄｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｗｅｅｎ－４０ ｏｒ ｂｉｏｔｉｎ ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ． Ｉｔ ｗａｓ ｃｏｎｃｌｕｄｅｄ ｔｈａｔ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｏｆ ｄｔｓＲ１ ｇｅｎｅ ｃｏｕｌｄ ｅｌｅｖａｔｅ ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｇｌｕｔａｍａｔｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｅｖｅｎ ｉｎ ｔｈｅ ａｂｓｅｎｃｅ ｏｆ ａｎｙ ｉｎｄｕｃｉｎｇ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ； ｄｔｓＲ１ ｇｅｎｅ；ｇｌｕｔａｍａｔｅ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ
谷氨酸是１８６６年由德国的Ｒｉｔｔｈａｕｓｅｎ博士从小麦面筋中分离得到的一种酸性氨基酸［１］。它大量存在于谷类蛋白质中，参与动物、植物和微生物中的许多重要化学反应。谷氨酸在医药、食品工业有着广泛的应用，在医学上其主要用于治疗肝性昏迷，还可用于改善儿童智力发育；在食品工业上，谷氨酸－钠盐（味精）是常用的增鲜剂［２，３］。
现代化生产谷氨酸的方法主要是微生物发酵，在适当的条件下，微生物可利用自身的新陈代谢积累合成Ｌ－谷氨酸。目前工业上应用的谷氨酸产生菌主要是棒状杆菌属、短杆菌属、小杆菌属及节杆菌属中的细菌。其中谷氨酸棒状杆菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）是目前工业生产最常用的菌株之一［４，５］。
乙酰辅酶Ａ羧化酶（ＤｔｓＲ蛋白）是乙酰辅酶Ａ（乙酰ＣｏＡ）羧化酶复合体的组分之一。乙酰ＣｏＡ羧化酶复合体是参与脂肪酸合成的生物素结合酶，它由生物素结合亚基和羧基转移酶亚基构成，其中ＤｔｓＲ蛋白和谷氨酸合成密切相关［６］。将ｄｔｓＲ１基因敲除后，发现谷氨酸合成增加，因此ＤｔｓＲ１蛋白可以影响谷氨酸合成途径。本试验利用基因敲除技术筛选获得△ｄｔｓＲ１突变菌株，观察ｄｔｓＲ１基因缺失对谷氨酸棒状杆菌的谷氨酸产量的影响。
１ 材料与方法
１．１ 材料
１．１．１ 试验菌株 谷氨酸棒状杆菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）及已经定向缺失ｄｔｓＲ１基因的△ｄｔｓＲ１突变菌株由淮阴工学院生命科学与化学工程学院生物工程实验室构建并保存。
１．１．２ 培养基 ＬＢ培养基的配制见《分子克隆实验指南（第三版）》［７］。基础发酵培养基：葡萄糖３０ ｇ／Ｌ，（ＮＨ４）２ＳＯ４ １５ ｇ／Ｌ，ＫＨ２ＰＯ４ １ ｇ／Ｌ，ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ０．４ ｇ／Ｌ，ＦｅＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ０．０１ ｇ／Ｌ，ＭｎＳＯ４·４Ｈ２Ｏ ０．０１ ｇ／Ｌ，维生素Ｂ１ ２００ μｇ／Ｌ，生物素３００ μｇ／Ｌ，大豆蛋白水解物（总氮量为３５ ｇ／Ｌ），ＣａＣＯ３ ５０ ｇ／Ｌ，用ＫＯＨ调至ｐＨ ８．０。
１．２ 方法
１．２．１ 种子摇瓶培养 将菌株从新鲜的ＬＢ平板上接种到含３０ ｍＬ ＬＢ－葡萄糖培养基（含１．２ ｍＬ ５００ ｇ／Ｌ葡萄糖母液）的５００ ｍＬ三角瓶中，于３０ ℃以１２０ ｒ／ｍｉｎ培养过夜。
１．２．２ 发酵摇瓶培养 将种子液添加到含２０ ｍＬ基础发酵培养基的５００ ｍＬ三角瓶中，于３０℃以１２０ ｒ／ｍｉｎ培养３６ ｈ进行谷氨酸发酵。