【兰坪铅锌尾矿区根瘤菌对铅锌响应研究】兰坪铅锌

　　摘要：以从兰坪铅锌尾矿区已分离纯化的１０株豆科植物根瘤菌为研究对象，用含50～１ ５００ ｍｇ／Ｌ的铅、200～２ ０００ ｍｇ／Ｌ的锌的单盐ＹＭＡ培养基和双盐培养基进行培养，观察根瘤菌的生长情况，筛选出３株耐（抗）铅锌菌株，分别为菌株１４．２．９、１８．２．１７、３．２．３。结合生理生化指标的测定结果，发现耐性强的菌株对各种糖利用特征与其他菌有所不同，能产酸而不产气；分解利用油脂、淀粉、明胶等物质的能力高于耐性弱的根瘤菌。说明在兰坪尾矿区根瘤菌存在多种生理类型，很可能通过改变代谢途径适应重金属污染的环境。
　　关键词：兰坪尾矿区；铅锌；根瘤菌；耐性；响应
　　中图分类号：Ｑ９４５．７８文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０11）13－2639-03
　　
　　Ｓｔｕｄｙ ｏｎ ｔｈｅ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ Ｌｅａｄ ａｎｄ Ｚｉｎｃ ｏｆ Ｒｈｉｚｏｂｉａ Ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ Ｌａｎｐｉｎｇ
　　Ｌｅａｄ-Ｚｉｎｃ Ｍｉｎｉｎｇ Ｔａｉｌｉｎｇｓ
　　
　　ＺＨＡＮＧ Ｗｕ－ｘｉａｎａ，ＷＡＮＧ Ｊｉｎ－ｈｕａｂ，ＸＩＯＮＧ Ｚｈｉｂ，ＨＡＯ Ｍｉｎｇｂ，ＸＩＥ Ｑｉ－ｔａｎｇｂ
　　（ａ． Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｉｎｕｉｎｇ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ； ｂ． Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｋｕｎｍｉｎｇ ６５０２２４， Ｃｈｉｎａ）
　　
　　Ａｂｓｔｒａｃｔ： The ceｌｌ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ １０ ｒｈｉｚｏｂｉａ ｏｆ ｌｅｇｕｍｉｎｏｕｓ ｐｌａｎｔｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ Ｌａｎｐｉｎｇ ｌｅａｄ－ｚｉｎｃ （Ｐｂ－Ｚｎ） ｍｉｎｉｎｇ ｔａｉｌｉｎｇｓ ｗｅｒｅ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｏｎ ＹＭＡ ｃｕｌｔｕｒｅ ｐｌａｔｅｓ adding ５０～１ ５００ ｍｇ／Ｌ Ｐｂ２＋， ２００～２ ０００ ｍｇ／Ｌ Ｚｎ２＋ or disalt． Three strains，３．２．３， １４．２．９ ａｎｄ １８．２．１７ ｗｅｒｅ ｓｃｒｅｅｎｅｄ ｏｕｔ ａｓ Ｐｂ－Ｚｎ ｈｉｇｈ ｒｅｓｉｓｔａnｃｅ ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｓｔｒａｉｎｓ． Ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｐａｔｈｗａｙｓ ｏｆ ｓｔｒａｉｎ １４．２．９，１８．２．１７，３．２．３ ｗｅｒｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｐｂ－Ｚｎ ｌｏｗ ｒｅｓｉｓｔａｃｅ ｓｔｒａｉｎｓ， ｔｈｅｓｅ ３ ｒｈｉｚｏｂｉａ ｆｅｒｍｅｎｔｅｄ ｔｏ ｐｒｏｄｕｃｅ ｓｏｕｒ instead of gas， ａｎｄ ｔｈｅｙ ｈａｄ ｈｉｇｈ ａｂｉｌｉｔｙ of hydrolyzing ｌｉｐｉｎ， ｓｔａｒｃｈ ａｎｄ ｇｅｌａｔｉｎｅ ｅｔ ａｌ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｃｏｎｆｉｒｍｅｄ ｔｈａｔ ｒｈｉｚｏｂｉａ ｉｎ Ｌａｎｐｉｎｇ Ｐｂ－Ｚｎ ｍｉｎｉｎｇ ｔａｉｌｉｎｇｓ ｈａｄ ａｂｕｎｄａｎｔ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ． Ｔｈｅ ａｄａｐｔｉｏｎ ｏｆ ｒｈｉｚｏｂｉａ ｔｏ ｔｈｅ Ｐｂ－Ｚｎ ｐｏｌｌｕｔｉｏｎ was ｐｒｏｂａｂｌｙ ｒｅｓｕｌｔｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｃｈａｎｇｅ ｏｆ ｔｈｅｉｒ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｐａｔｈｗａｙ．
　　Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｌａｎｐｉｎｇ ｍｉｎｉｎｇ ｔａｉｌｉｎｇｓ； ｌｅａｄ－ｚｉｎｃ； ｒｈｉｚｏｂｉａ； ｄｅｇｒｅｅ ｏｆ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ； ｒｅｓｐｏｎｓｅ
　　
　　兰坪白族普米族自治县隶属云南省怒江傈僳族自治州，矿藏资源极其丰富，享有“云南有色金属之乡”的盛誉。金顶凤凰山特大铅（Ｐｂ）锌（Ｚｎ）矿，储量达１ ４２９万金属吨，位居全国之首、世界第二［１］。兰坪铅锌矿山经过数十年大规模地开采，尾矿区的生态受到严重破坏，重金属污染严重。尾矿区植被恢复的最重要限制因子之一是养分的不足，而氮素的极端不足又是养分不足的核心问题［２］。在兰坪铅锌尾矿区自然生长有多种豆科植物，大多豆科植物都能与根瘤菌构成共生体系而固氮，增加土壤肥力，增强植物抗逆性，促进植物生长，这一体系的构建将有助于尾矿区植被的恢复［３，４］。
　　目前，国内外对于兰坪铅锌尾矿区豆科植物根瘤菌的影响仅见于缪福俊等［５］的研究。本研究针对该尾矿区豆科植物根瘤菌的铅锌响应进行分析，希望找到铅锌抗性强的根瘤菌，以期为采用合适的“根瘤菌-豆科植物”共生体系改良兰坪铅锌尾矿土壤及植被恢复提供依据。
　　１材料与方法
　　１．１供试菌株及培养基
　　西南林业大学生命科学学院特殊环境固氮菌课题组保存的１０株分离筛选自兰坪铅锌尾矿区自然生长的9种豆科植物根瘤菌纯种（表１），活化后待用。细菌固体培养基为牛肉膏蛋白胨培养基（ＹＭＡ培养基），调ｐＨ值至７．０～７．２，１２１ ℃灭菌２０ ｍｉｎ。
　　１．２生理生化指标测定
　　按沈萍等［６］的方法，分别测定１０株根瘤菌生理生化指标（油脂水解、淀粉水解、Ｖ．Ｐ．试验、Ｍ．Ｒ．试验、明胶液化、吲哚试验、糖发酵试验）。
　　１．３土壤铅锌含量的测定
　　土壤铅、锌含量使用ＡＡＮＡ／ＹＳＴ １００型原子吸收光谱仪进行测定。测定土壤锌参照ＧＢ／Ｔ １７１３８－１９９７，土壤铅参照ＧＢ／Ｔ １７１４１－１９９７。
　　１．４铅锌响应试验
　　以兰坪铅锌尾矿区的土壤重金属含量测定结果为依据，将ＹＭＡ培养基灭菌冷却至５０ ℃，按剂量添加１００ ｍｇ／Ｌ（以Ｚｎ２＋、Ｐｂ２＋计量）的ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ和Ｐｂ（Ｃ２Ｈ３Ｏ２）・３Ｈ２Ｏ溶液，制成含不同浓度梯度的铅、锌单盐及铅锌双盐重金属选择性ＹＭＡ培养基。
　　单因素试验：将供试菌株接种在含有不同浓度单盐的ＹＭＡ培养基上，铅盐浓度依次是５０、２００、４００、６００、１ ０００、１ ５００ ｍｇ／Ｌ（分别用１～６表示）；锌盐浓度依次是２００、４００、８００、１ ２００、１ ６００、２ ０００ ｍｇ／Ｌ（分别用１～６表示）；以无重金属的ＹＭＡ平板为对照，接种，２８ ℃培养观察２～１０ ｄ，生长记为“＋”，不生长记为“－”［７］。
　　双因素试验：将供试菌株接种在不同浓度的铅锌双盐ＹＭＡ培养基上，铅、锌重金属浓度梯度设置如表２所示，以无重金属的ＹＭＡ平板作对照，接种，２８ ℃培养观察２～１０ ｄ，记录同上。
　　２结果与分析
　　２．１生理生化指标特性
　　由表３可知，供试的１０株根瘤菌存在多种的代谢类型，来自同一株植物（美丽胡枝子）分离的根瘤菌代谢类型也不同。菌株１４．２．９、１８．２．１７、３．２．３分解利用油脂、淀粉、明胶的能力均较强；均能发酵葡萄糖，产酸不产气；菌株１８．２．１７、３．２．３能发酵乳糖，产酸不产气。
　　２．２尾矿区土壤铅锌含量
　　通过兰坪铅锌尾矿区土壤重金属含量与其他土壤重金属含量均值的对比，发现兰坪地区的总Ｐｂ的含量分别是全国及云南省土壤（Ａ层）背景均值的１３８．６０倍和８８．７６倍；有效Ｚｎ的含量远高于华南5个铅锌尾矿区均值［８］，是全国及云南省土壤（Ａ层）背景均值的７０．０８倍和５７．９７倍。说明兰坪铅锌尾矿区Ｐｂ、Ｚｎ含量较高，重金属污染严重（表４）。
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　　从铅锌对根瘤菌生长的影响情况（表５）可以看出，多数根瘤菌在低浓度锌（＜８００ ｍｇ／Ｌ）胁迫下可以生长，有良好的耐锌能力，但根瘤菌对铅的耐受力较低，在６００ ｍｇ／Ｌ的铅胁迫下只有１株根瘤菌能够生长，这可能与兰坪铅锌尾矿区高锌低铅的土壤特性有关。
　　另有研究［９］表明，低浓度的重金属能刺激微生物的生长，但超过一定浓度时对微生物则有毒害效应。从表５可以看出，根瘤菌在铅锌双盐胁迫下的生长情况与单盐不同。在含低浓度锌的双盐胁迫下，５０％的根瘤菌生长良好，证明低浓度锌可以缓解铅对微生物的毒害作用。菌株３．２．３、１８．２．１７、１４．２．９对铅锌双盐胁迫有较强的耐（抗）能力，菌株３．２．３为铅锌高耐（抗）性菌株。
　　结合生理生化指标分析，结果显示耐性强的菌株对各种糖利用特征与其他菌有所不同，能产酸而不产气；其分解利用油脂、淀粉、明胶等物质的能力高于耐性弱的根瘤菌。说明在兰坪铅锌尾矿区根瘤菌存在多种生理类型，很可能通过改变代谢途径适应重金属污染的环境。可见，生理生化指标可以作为初步筛选高抗性菌株的参考指标。
　　３结论
　　通过对分离自兰坪铅锌尾矿区的１０株豆科植物根瘤菌的铅锌响应试验及生理生化指标的测定，筛选到３株对铅锌双盐胁迫有较强的耐（抗）能力的菌株，分别为菌株３．２．３、１８．２．１７、１４．２．９，其中菌株３．２．３可耐受１ ０００ ｍｇ／Ｌ Ｐｂ２＋＋１ ６００ ｍｇ／Ｌ Ｚｎ２＋，是与香豌豆共生的铅锌高耐（抗）性菌株。铅锌共同作用时，低浓度锌（＜８００ ｍｇ／Ｌ）可以缓解铅对微生物的毒害作用。根瘤菌的铅锌耐性可能与生理生化特征相关，细胞通过代谢途径发生变化来增加对铅锌的抗性，适应环境。
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　　［６］ 沈萍，陈向东． 微生物学实验［Ｍ］． 第四版． 北京：高等教育出版社，２００７．
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