多克隆抗体制备_睾酮多克隆抗体的制备及免疫学检测方法的建立
摘要：采用优化的碳化二亚胺法制备睾酮（ＴＥＳ）人工抗原，免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体，建立间接竞争ＥＬＩＳＡ标准曲线。标准曲线在ＰＢＳ中的线性检测范围为０．０９６～９２．２00 ｎｇ／ｍＬ，相关系数Ｒ２＝０．９７２ ２，半数抑制浓度（ＩＣ５０）为２．８00 ｎｇ／ｍＬ，最低检测限（ＬＯＤ）为０．０３５ ｎｇ／ｍＬ；抗体与去甲睾酮的交叉反应率为２２．３％，与其他检测化合物的交叉反应很小或忽略不计。羊尿２０倍稀释后进行添加回收试验，其添加值与检测值的相关系数为０．９８５ ２。因此，该免疫学方法可用于动物尿液中睾酮残留水平的定量分析。
关键词：睾酮；人工抗原；多克隆抗体；间接竞争ＥＬＩＳＡ
中图分类号：Ｓ８５９．７９ 文献标识码：Ａ 文章编号：0439－８114（２０12）16－3554-03
Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｔｓ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ ｏｆ Ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ
ＬＩ Ｃｈａｏ－ｙｉｎｇ１，２，ＪＩＡＮＧ Ｊｉｎ－ｑｉｎｇ２，ＬＩ Ｆｅｎｇ－ｙｕｎ２，ＹＡＮＧ Ｊｉｎ－ｍｉｎｇ２，ＷＵ Ｓｈｉ－ｘｉｕ２， ＬＩＵ Ｍｉｎｇ－ｃｈｅｎｇ２
（１． Ｃｅｎｔｒｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ， Ｘｉｎｘｉａｎｇ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｘｉｎｘｉａｎｇ ４５３００３， Ｈｅｎａｎ，Ｃｈｉｎａ；
２． Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｈｅｎａｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｘｉｎｘｉａｎｇ ４５３００３， Ｈｅｎａｎ，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ａ ｓｔａｎｄａｒｄ ｃｕｒｖｅ ｏｆ ｉｎｄｉｒｅｃｔ ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ＥＬＩＳＡ （ｉｃＥＬＩＳＡ） ｗａｓ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ （ＴＥＳ） ｒｅｓｉｄｕｅ ｉｎ ｕｒｉｎｅ． Ｔｈｅ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ａｎｔｉｇｅｎ ｏｆ ＴＥＳ ｗａｓ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ ｂｙ ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ ｍｅｔｈｏｄ （ＥＤＣ） ａｎｄ ｔｈｅｎ ｕｓｅｄ ｔｏ ｉｍｍｕｎｅ Ｎｅｗ Ｚｅａｌａｎｄ ｗｈｉｔｅ ｒａｂｂｉｔｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｌｉｎｅａｒ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｒａｎｇｅ ｏｆ ｔｈｅ ｓｔａｎｄａｒｄ ｃｕｒｖｅ ｉｎ ＰＢＳ ｗａｓ ｆｒｏｍ ０．０９６ ｔｏ ９２．２00 ｎｇ／ｍＬ， ｔｈｅ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ （Ｒ２） ｗａｓ ０．９７２ ２， ｔｈｅ ｌｉｍｉｔ ｏｆ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ（ＬＯＤ） ａｎｄ ＩＣ５０ ｖａｌｕｅ ｗａｓ ０．０３５ ｎｇ／ｍＬ ａｎｄ ２．８00 ｎｇ／ｍＬ， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． Ｔｈｅ ｃｒｏｓｓ－ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｏ ｎｏｒｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ ｗａｓ ２２．３％ ａｎｄ ｓｌｉｇｈｔ ｏｒ ｎｅｇｌｉｇｉｂｌｅ ｔｏ ｏｔｈｅｒ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ． Ｕｎｄｅｒ ２０－ｆｏｌｄ ｄｉｌｕｔｉｏｎ ｉｎ ｓｈｅｅｐ ｕｒｉｎｅ， ａ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｏｆ ０．９８５ ２ ｂｅｔｗｅｅｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ａｄｄｅｄ ａｎｄ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｗａｓ ｏｂｓｅｒｖｅｄ． Ｉｔ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｉｓ ａｓｓａｙ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ ｉｎｔｏ ａ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｐｒｏｇｒａｍ ｆｏｒ ｔｈｅ ｒａｐｉｄ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｏｆ ＴＥＳ ｒｅｓｉｄｕｅ ｉｎ ｕｒｉｎｅ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ； ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ａｎｔｉｇｅｎ； ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ； ｉｎｄｉｒｅｃｔ ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ＥＬＩＳＡ
类固醇激素是生物体内产生的一类调节机体代谢功能的微量物质，又称化学信息素。此类物质有较强的蛋白质同化作用，可以提高蛋白质沉积，降低脂肪含量，从而提高饲料转化效率［１］。睾酮是哺乳动物体内常见的具有雄激素作用的类固醇激素，它可以增加肌肉含量，提高骨骼强度，并在雄性生殖器官的发育中发挥重要作用，因而在临床医学中得到应用。外源性睾酮也被运动员非法使用，以提高比赛成绩；养殖场使用睾酮激素后，可以提高经济效益。然而，长期摄入睾酮类激素会导致消费者内分泌紊乱、性早熟，大大增加致癌、致畸的风险［２］。因此，自１９８６年以来，欧盟委员会就禁止在肉食性动物养殖中以促进生长为目的使用自然或人工合成的激素，以保护消费者可能因食用激素的残留物或其代谢物而引起的发育问题、神经问题、遗传毒性和癌症问题［３］。睾酮传统的理化检测方法包括液相色谱－质谱（ＬＣ－ＭＳ）［１，４］和气相色谱－串联质谱（ＧＣ－ＭＳ／ＭＳ）［５］等方法。这些方法灵敏度高、特异性强，但样品前处理繁琐，不适合大批量的市场监测要求。而免疫学检测方法建立在抗体对抗原的分子识别上，其主要优点是亲合力高、快速、简单、经济实用，能够实现对生物液体的小体积、大批量检测，逐渐成为世界各国有毒有害残留物快速检测的方法之一［６］。
本研究以睾酮标准品为起始反应物，经过一系列化学反应制备人工抗原，通过免疫新西兰大白兔获得兔抗睾酮的血清，建立间接竞争ＥＬＩＳＡ检测方法。该研究可以优化液质联用和气质联用等理化方法的样品前处理过程，同时为免疫检测试剂盒和试纸条的研制提供基础。
１ 材料与方法
１．１ 试剂与材料