[一种糖尿病食疗酵母及其构建方法]美国糖酵母能治糖尿病吗

　　南开大学生命科学学院李明刚教授领导的生物技术与新药研究室，最近研究成功具有预防和治疗糖尿病效果的可食用酵母，并申报了国家发明专利(申请号：200910068037.7)。
　　酿酒酵母及其培养物作为益生菌能够通过活的细胞或其他活性因子改善机体胃肠道微生态环境，刺激有益菌的生长繁殖，抑制有害菌的生长繁殖，维持肠道微生态平衡，无抗药性，无残留，无毒副作用，能提高机体的免疫能力和抗应激能力，减少腹泻等疾病。
　　胰高血糖素样肽-1(GLP-1)又称肠促胰岛素，是一种分泌自肠道细胞的肽激素，具有血糖依赖性促胰岛素分泌、促进β-细胞再生、抑制β-细胞凋亡等多种生理功能，在2型糖尿病的临床治疗中具有较好的应用前景。
　　李明刚教授科研小组的该项发明提供了一种糖尿病食疗酵母及其构建方法，集酿酒酵母的益生养身作用和肠促胰岛素的降糖治病功能于一体。他们首先对编码天然GLP-1基因的核苷酸序列重新设计，将天然GLP-1第8，26和34位氨基酸替换，消除其DPP-IV酶和胰蛋白酶位点，使其能够抵抗体内DPP-IV酶和胰蛋白酶降解而延长其体内半衰期，通过DNA合成技术分别合成I型、II型和左右连接补平引物片段，对各片段磷酸化后，采用分步退火一步连接法获得多拷贝长效促胰岛素(IaGLP-1)串联融合基因(每一个拷贝的c末端与后一个拷贝的N末端相连)。巧妙利用IaGLP-1的c末端最后一个氨基酸是精氨酸，恰好是胰蛋白酶酶切位点的特点，每一个IaGLP-1拷贝的C末端与下一个拷贝的N末端相连，在未增加任何多余氨基酸的情况下使每个拷贝的结合部均为胰蛋白酶酶切位点，保证其在食用后被胃肠道内的胰蛋白酶切割释放有效IaGLP-1单体，发挥其促进胰岛素分泌，降低血糖、抑制胰岛β-细胞凋亡和促进β-细胞再生的功能，达到预防和治疗糖尿病的效果。
　　获得稳定高效表达多拷贝laGLP-1串联融合基因酿酒酵母，必须构建稳定、高效、安全的表达载体。他们利用PCR方法扩增得到两段酿酒酵母核糖体RNA基因(rDNA)序列，酿酒酵母乳清酸核苷-5’一单磷酸脱羧酶基因URA3以及来自质粒pYX212的表达元件(TPI表达盒)，并将上述扩增得到的DNA序列分别克隆到质粒pUCl8的Sacl／EcoRI，PstI位点、Sail／Xbal和XbaI／Kpnl位点，构建了整合型载体pNKl。将克隆的十拷贝IaGLP-1编码基因克隆到pNKl的BamHI／Smal位点构建了整合型酿酒酵母表达载体pN K-GLP。通过Hpal酶切使表达载体pNK-GLP线性化，并转化酿酒酵母BJ2407。为了便于筛选，在导入laGLP-1编码基因的同时-还将酿酒酵母乳清酸核苷-5’一单磷酸脱羧酶基因URA3一同导入酿酒酵母BJ2407，通过Ura+表型筛选获得稳定表达十拷贝IaGLP-1融合蛋白的重组酿酒酵母。在构建整合型表达载体过程未使用任何抗生素筛选标记，而是选用营养缺陷型URA3筛选标记，确保了构建的重组酿酒酵母食用安全。
　　酿酒酵母是公认的可食用的安全性微生物，被广泛应用于食品和药品生产。同时酿酒酵母本身富含维生素、消化酶等营养活性物质，还是传统的酵母茶或酵母饮料的原材料。本发明利用酿酒酵母体内易发生同源重组的特性，将带有酿酒酵母rDNA序列、具有抗DPp-IV和胰蛋白酶降解的十拷贝IaGLP-1编码基因表达盒整合到酵母基因组DNA中的rDNA串联多拷贝区，获得稳定高效表达laGLP-1的重组酵母。通过高血糖大鼠灌胃高剂量重组酿酒酵母的活体试验，证明稳定高效表达laGLP-1的重组酵母具有明显降低高血糖大鼠血糖水平的生物学活性，该重组酿酒酵母有望被用于糖尿病的治疗。
　　糖尿病食疗酵母的构建成功，为采用有益微生物细胞作为药物载体或缓释胶囊研发具有高效降血糖活性的酵母生物药物提供了一条新的有效途径。