季也蒙毕赤酵母ypy17产脂肪酶条件的优化:脂肪酶

　　摘要：从海南洋浦近海岸分离到１株产脂肪酶的酵母菌株，经鉴定为季也蒙毕赤酵母（Ｐｉｃｈｉａ ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ），利用Ｐｌａｃｋｅｔｔ－Ｂｕｒｍａｎ设计对发酵条件进行了筛选。结果表明，橄榄油、初始ｐＨ值和Ｋ２ＨＰＯ４浓度对脂肪酶生产具有显著的影响；利用响应面法对３个因子进行了优化，获得了最佳发酵条件为橄榄油３１．５７ ｇ／Ｌ，硫酸铵 １０.00 ｇ／Ｌ，ＮａＣｌ ３０.00 ｇ／Ｌ，Ｋ２ＨＰＯ４ １．１６ ｇ／Ｌ，初始ｐＨ值７．３0，２８ ℃培养７２ ｈ，脂肪酶活力达到１８．２0 Ｕ／ｍＬ。
　　关键词：季也蒙毕赤酵母；脂肪酶；Ｐｌａｃｋｅｔｔ－Ｂｕｒｍａｎ设计；响应面法
　　中图分类号：Ｑ９３９．９７文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０11）12－2432-03
　　
　　Condition Optimization of Lipase Production from Pichia guilliermondii ypy17
　　
　　ＬＩ Ｘｉａｏ－ｙｕ１，２，ＬＵＯ Ｙａｎ－ｐｉｎｇ１，２，ＬＩＵ Ｚｈｉ－ｑｉａｎｇ１，２，ＱＩＵ Ｂｏ２
　　（１．Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｒｏｐｉｃａｌ Ｃｒｏｐ Ｇｅｒｍｐｌａｓｍ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ （Ｈａｉｎａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ） Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ，Ｈａｉｋｏｕ ５７０２２８，Ｃｈｉｎａ；２．Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ ａｎｄ Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ， Ｈａｉｎａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｄａｎｚｈｏｕ ５７１７３７， Ｈａｉｎａｎ， Ｃｈｉｎａ）
　　
　　Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ａ ｌｉｐａｓｅ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｙｅａｓｔ Ｐｉｃｈｉａ ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ ｙｐｙ１７ ｗａｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｃｏａｓｔａｌ ｗａｔｅｒ ｏｆ Ｙａｎｇｐｕ ｉｎ Ｈａｉｎａｎ． Ｐｌａｃｋｅｔｔ－Ｂｕｒｍａｎ ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ（ＲＳＭ） ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ｔｏ ｏｐｔｉｍｉｚｅ ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｏｆ ｌｉｐａｓｅ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｏｌｉｖｅ ｏｉｌ， ｉｎｉｔｉａｌ ｐＨ ａｎｄ Ｋ２ＨＰＯ４ ｗｅｒｅ ｔｈｅ ｍｏｓｔ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｆａｃｔｏｒｓ influencing ｌｉｐａｓｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ． Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｄｉｕｍ ｗａｓ ｏｌｉｖｅ ｏｉｌ ３１．５７ ｇ／Ｌ， （ＮＨ４）２ＳＯ４ １０.00 ｇ／Ｌ， ＮａＣｌ ３０.00 ｇ／Ｌ， Ｋ２ＨＰＯ４ １．１６ ｇ／Ｌ， ｉｎｉｔｉａｌ ｐＨ ７．３0． Ａｆｔｅｒ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ， ｔｈｅ ｌｉｐａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｗａｓ １８．２0 Ｕ／ｍＬ．
　　Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｐｉｃｈｉａ ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ； ｌｉｐａｓｅ； Ｐｌａｃｋｅｔｔ－Ｂｕｒｍａｎ ｄｅｓｉｇｎ； ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ
　　
　　脂肪酶是指可以催化三脂酰甘油水解产生甘油和游离脂肪酸或催化甘油与长链脂肪酸合成酯的酶［１］。脂肪酶广泛存在于自然界中，但是仅仅微生物产生的脂肪酶具有生产应用价值，因为微生物产生的脂肪酶产量高，而且功能多样，在油脂水解、食品加工、化妆品、医药、化工等工业领域中具有广泛的应用，已成为继蛋白酶、淀粉酶之后跃居世界工业酶制剂市场销量第三位的酶种，具有良好的发展和应用前景［１］。许多微生物都可以产生脂肪酶，在陆地酵母中，现已发现褶皱假丝酵母（Ｃａｎｄｉｄａ ｒｕｇｏｓａ）、热带假丝酵母（Ｃ． ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、大西洋假丝酵母（Ｃ． ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）、柱状假丝酵母（Ｃ． ｃｙｌｉｎｄｒａｃｅａ）、近平滑假丝酵母（Ｃ． ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ）、粗状假丝酵母（Ｃ． ｖａｌｉｄａ）、解脂耶罗维亚酵母（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、粘红酵母（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ ｇｌｕｔｉｎｉｓ）、墨西哥毕赤酵母（Ｐｉｃｈｉａ ｍａｘｉｃａｎａ）、森林毕赤酵母（Ｐｉｃｈｉａｓｉｌｖｉｃｏｌａ）、木糖毕赤酵母（Ｐｉｃｈｉａｘｙｌｏｓａ）、博丁尼毕赤酵母（Ｐｉｃｈｉａ ｂｕｒｔｏｎｉｉ）等［２］。目前用于工业生产脂肪酶的酵母菌主要有褶皱假丝酵母（Ｃ． ｒｕｇｏｓａ）和大西洋假丝酵母（Ｃ． ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）［２］。然而，对于来自于海洋的酵母生产脂肪酶的研究较少。研究以从海南洋浦近海分离到1株产脂肪酶的酵母菌（鉴定为季也蒙毕赤酵母）为材料，利用响应面法对其产脂肪酶的条件进行了优化，现将结果报告如下。
　　１材料与方法
　　１．１材料
　　１．１．１菌株季也蒙毕赤酵母ｙｐｙ１７，由海南大学热带作物种质资源保护与开发利用教育部重点实验室自从海南洋浦近海分离并鉴定保存。
　　１．１．２培养基种子培养基：蛋白胨２０.00 ｇ／Ｌ，酵母粉１０.00 ｇ／Ｌ，葡萄糖２０.00 ｇ／Ｌ。发酵培养基：橄榄油１０.00 ｇ／Ｌ，硫酸铵１０.00 ｇ／Ｌ，ＮａＣｌ ３０.00 ｇ／Ｌ，Ｋ２ＨＰＯ４ ０．５0 ｇ／Ｌ，ｐＨ 值７．０。
　　１．２方法
　　１．２．１脂肪酶活力测定新鲜菌种接种种子液，２８ ℃培养２４ ｈ，以４％接种量接入发酵培养基，２８ ℃培养７２ ｈ，５ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心发酵液，取上清液测定脂肪酶活力。脂肪酶的活力测定采用ｐ-ＮＰ法［３］。酶活力单位（Ｕ）定义为每分钟释放出1 μｍｏｌ对硝基酚（ｐ-ＮＰ）的酶量。
　　１．２．２Ｐｌａｃｋｅｔｔ－Ｂｕｒｍａｎ设计使用Ｄｅｓｉｇｎ ｅｘｐｅｒｔ ７．０软件，选用１１因素、试验次数为１２的Ｐｌａｃｋｅｔｔ－Ｂｕｒｍａｎ设计，考查各因素对产酶影响的显著性。
　　１．２．３响应面分析根据响应面法中心组合设计（Ｃｅｎｔｒａｌ ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ ｄｅｓｉｇｎ，ＣＣＤ）原理，对选取的显著因子从５个水平进行考查，以确定最优条件。
　　２结果与分析
　　２．１Ｐｌａｃｋｅｔｔ-Ｂｕｒｍａｎ设计
　　选用试验次数ｎ＝１２的试验设计，对１１个因素（６个实际因素，５个虚拟因素）进行考查，响应值为酶产量。６个实际因素分别从两个水平（－１，＋１）来考查，试验设计见表１，各因素效应结果见表２。从表２可以看出，橄榄油浓度、初始ｐＨ值和Ｋ２ＨＰＯ４浓度３个因子的影响是显著的，因此对这３个显著因子进一步优化。
　　２．２响应面优化
　　对于Ｐｌａｃｋｅｔｔ-Ｂｕｒｍａｎ设计选择的３个显著因子（橄榄油浓度、初始ｐＨ值和Ｋ２ＨＰＯ４浓度），从５个水平（－α，－１，０，１，α）进行考查（表３），共进行２０组试验，每组试验均测定酶产量，试验设计及每组试验对应的酶产量见表４。
　　根据试验结果，由软件获得拟合方程为：
　　＝－５１．５５＋０．２５ｘ１＋１４．４６ｘ２＋２４．１６ｘ３＋０．０９ｘ１ｘ２＋０．１９ｘ１ｘ３－２．６１ｘ２ｘ３－０．０２ｘ１２－０．９７ｘ２２－４．７６ｘ３２
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　　２．３响应面分析
　　对表４的试验结果做响应面曲线见图１和图２。图１表示Ｋ２ＨＰＯ４浓度为１.00 ｇ／Ｌ时，橄榄油浓度和初始ｐＨ值对酶产量的影响。从图１可以看出，橄榄油浓度较初始ｐＨ值对脂肪酶产量的影响更为显著，当橄榄油浓度在２８.00～３２.00 ｇ／Ｌ之间时，酶产量相对较高，橄榄油浓度大于３５.00 ｇ／Ｌ或小于２５.00 ｇ／Ｌ时，酶产量下降较快。图２表示橄榄油浓度为３０．０0 ｇ／Ｌ时，初始ｐＨ值和Ｋ２ＨＰＯ４浓度对酶产量的影响。从图２可以看出，初始ｐＨ值小于７．０0，Ｋ２ＨＰＯ４浓度小于１．００ ｇ／Ｌ时，脂肪酶产量下降得很快。根据软件预测，当橄榄油浓度为３１．５７ ｇ／Ｌ、初始ｐＨ值为７．３0、Ｋ２ＨＰＯ４浓度为１．１６ ｇ／Ｌ时，脂肪酶活力最高，为１８．９０ Ｕ／ｍＬ。
　　２．４验证试验
　　按照优化后的产酶条件：橄榄油３１．５７ ｇ／Ｌ，硫酸铵１０.00 ｇ／Ｌ，ＮａＣｌ ３０.00 ｇ／Ｌ，Ｋ２ＨＰＯ４ １．１６ ｇ／Ｌ，初始ｐＨ值为７．３0，２８ ℃培养７２ ｈ，试验测得酶活力为１８．２０ Ｕ／ｍＬ，与预测值１８．９０ Ｕ／ｍＬ比较接近，说明该试验设计与响应面分析方法能够较好地模拟该脂肪酶实际的生产过程，结果可靠。
　　３小结与讨论
　　Ｐｌａｃｋｅｔｔ－Ｂｕｒｍａｎ设计和响应面法具有简易、迅速、可靠等优点，能快速有效地从众多影响因素中筛选出重要因素并实现其水平优化［４］。响应面法已经被成功应用到许多微生物脂肪酶发酵过程优化当中，于琼等［５］利用响应面法对一株假单胞菌产低温脂肪酶的发酵条件进行了优化；郑美玲等［６］利用响应面法对一株假丝酵母产脂肪酶的培养条件进行了优化，响应面设计选取了酵母膏、橄榄油和初始ｐＨ值３个因子，优化了培养基配方；岳珂等［７］对一株解脂假丝酵母产脂肪酶的发酵条件进行了优化，Ｐｌａｃｋｅｔｔ－Ｂｕｒｍａｎ设计筛选出３个显著因素为蛋白胨、ＫＨ２ＰＯ４和初始ｐＨ值，采用响应面分析法确定了其最优发酵条件。
　　试验结果表明，利用Ｐｌａｃｋｅｔｔ－Ｂｕｒｍａｎ设计对一株季也蒙毕赤酵母产脂肪酶的发酵条件进行筛选，筛选出３个显著因素，即橄榄油浓度、初始ｐＨ值和Ｋ２ＨＰＯ４浓度。利用响应面法对３个显著因子进行了优化，建立了脂肪酶产量与３个因子间的数学模型，通过响应面图分析及软件预测，优化了发酵条件为橄榄油３１．５７ ｇ／Ｌ，硫酸铵１０.00 ｇ／Ｌ，ＮａＣｌ ３０.00 ｇ／Ｌ，Ｋ２ＨＰＯ４ １．１６ ｇ／Ｌ，初始ｐＨ值为７．３0，２８ ℃培养７２ ｈ，脂肪酶的实测活力达到１８．２０ Ｕ／ｍＬ。
　　参考文献：
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　　［４］ 阎金勇，杨江科，闫云君． 单因素－响应面法优化白地霉Ｙ１６２ 产脂肪酶条件［Ｊ］． 中国生物工程杂志，２００７，２７（８）：６２－６８．
　　［５］ 余琼，梁运祥． 产低温脂肪酶假单胞菌的选育及产酶条件的优化［Ｊ］． 湖北农业科学， ２００６，４５（５）：６６２－６６５．
　　［６］ 郑美玲，林玲玲，杨海龙． 假丝酵母Ｃａｎｄｉｄａ ｓｐ．发酵生产脂肪酶培养条件的优化［Ｊ］． 温州大学学报，２００８，２９（５）：３０－３５．
　　［７］ 岳珂，陈振明，开雷，等． 响应面法优化解酯假丝酵母Ｃａｎｄｉｄａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ产脂肪酶发酵条件［Ｊ］． 科技通报，２００８，２４（６）：８１０－８１４．
　　注：本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文
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