贵州省稻瘟病菌遗传谱系与生理小种关系_稻瘟病菌

　　摘要：为厘清贵州省稻瘟病菌主要菌株的遗传谱系的划分及遗传谱系与生理小种的关系，采用基因组重复序列ＰＣＲ技术（ｒｅｐ－ＰＣＲ）对贵州省的稻瘟病菌进行基因组指纹分析，结果显示从１５４个供试菌株分别扩增到２～１５条ＤＮＡ带，经ＤＰＳ分析软件聚类分析，在欧氏距离３．８５遗传相似水平处，供试菌株分为１２个遗传谱系。结合传统的植物病理学研究方法，通过对供试菌株的生理小种类型进行测定，将１５４个菌株分为６个组群２１个小种，其中ＺＢ群占优势，ＺＢ１、ＺＢ１３为优势小种。比较按遗传谱系和生理小种对菌株的分类，可见，菌株遗传谱系与生理小种间并不存在确定的一一对应关系，同一谱系可由多个不同生理小种菌株组成，而同一生理小种菌株亦可分属于不同的谱系。
　　关键词：稻瘟病菌；遗传谱系；生理小种；贵州省
　　中图分类号：Ｓ４３５．１１１文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０11）12－2438-03
　　
　　Study on Relationship between the Genetic Lineage and Physiologic Races of
　　Pyricularia oryzae in Guizhou Province
　　
　　ＪＩＡＮＧ Ｙｕ－ｌａｎ，ＴＡＮ Ｐｉｎｇ，ＸＩＡＮＧ Ｈｏｎｇ－ｑｉｏｎｇ
　　（Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｇｕｉｚｈｏｕ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕｉｙａｎｇ ５５００２５，Ｃｈｉｎａ）
　　
　　Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ ｃｌａｒｉｆｙ ｔｈｅ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅｔｉｃ ｌｉｎｅａｇｅ ａｎｄ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｌｉｎｅａｇｅ ａｎｄ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃ ｒａｃｅｓ ｏｆ Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ ｏｒｙｚａｅ ｉｎ Ｇｕｉｚｈｏｕ ｐｒｏｖｉｎｃｅ， ＤＮＡ ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔ ｏｆ Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ ｏｒｙｚａｅ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ Ｇｕｉｚｈｏｕ pｒｏｖｉｎｃｅ ｗａｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｂｙ ｒｅｐ－ＰＣＲ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ２ ｔｏ １５ ＤＮＡ ｂａｎｄｓ ｗｅｒｅ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｆｏｒ １５４ ｓｔｒａｉｎｓ； ａｎｄ ｔｈｅｓｅ ｓｔｒａｉｎｓ ｗｅｒｅ ａｃｃｏｍｍｏｄａｔｅｄ ｔｏ １２ ｇｅｎｅｔｉｃ ｌｉｎｅａｇｅｓ ａｔ ｔｈｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ ｏｆ ３．８５ ｉｎ ｔｈｅ ｃｌｕｓｔｅｒ ａｎａｌｙｓｉｓ ｂｙ ＤＰＳ． Ｔｈｅ １５４ ｓｔａｉｎｓ ｗａｓ ｄｉｖｉｄｅｄ ｉｎｔｏ ６ ｇｒｏｕｐｓ ２１ ｍｉｃｒｏｓｐｅｃｉｅｓ ｔｅｓｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ ｐｌａｎｔ ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｍｅｔｈｏｄ． Ｎｏ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｗａｓ ｆｏｕｎｄ ｂｅｔｗｅｅｎ ｇｅｎｅｔｉｃ ｌｉｎｅａｇｅ ａｎｄ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｒａｃｅｓ． Ｏｎｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｌｉｎｅａｇｅ ｍａｙ ｈａｖｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃ ｒａｃｅｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃ ｒａｃｅ ｍａｙ ｂｅｌｏｎｇ ｔｏ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｌｉｎｅａｇｅｓ．
　　Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ ｏｒｙｚａｅ； ｇｅｎｅｔｉｃ ｌｉｎｅａｇｅ； ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃ ｒａｃｅ； Ｇｕｉｚｈｏｕ pｒｏｖｉｎｃｅ
　　
　　由稻瘟菌［有性世代Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ ｍａｌｉｎｖｅｒｎｉａｎａ（Ｃａｔｔ．）Ｍｉｙａｋｅ，无性世代Ｐｙｒｉｃulａｒｉａ ｏｒｙｚａｅ Ｃａｖ．］引起的稻瘟病，广泛发生于世界各地稻区，是世界水稻生产中具毁灭性的病害之一［１，２］。防治该病最经济有效的办法是选育抗病品种，但目前生产上应用的水稻抗稻瘟病品种的抗性多属于垂直抗性，往往因稻瘟病菌致病性变异而导致品种抗性丧失，抗性品种的最佳种植年限一般仅能维持２～３年［３］。水稻品种抗病性丧失是寄主与病原物互作的结果，目前已能从基因水平上准确阐述寄主与致病菌之间的关系。自上世纪８０年代末Ｈａｍｅｒ等［４］报道从稻瘟病菌基因组中克隆到一重复的ＤＮＡ序列，将其用于病原菌的ＤＮＡ指纹分析［５］以来，ＤＮＡ指纹分析技术已被用于稻瘟病菌群体遗传研究［６－８］。研究表明，稻瘟病菌群体的遗传基础是由在ＤＮＡ水平上具有高度同源性的菌株组成的组群（Ｇｒｏｕｐ），或称遗传谱系（Ｇｅｎｅｔｉｃ ｌｉｎｅａｇｅ）构成。开展稻瘟病菌遗传谱系的研究可使稻瘟病在各个流行地区内的病原菌遗传变异信息被更准确地掌握，有助于指导开展持久抗稻瘟病品种育种，通过合理利用水稻抗性，延长抗性品种的抗病年限，把水稻稻瘟病抗性育种水平推上一个新台阶。试验对贵州省内采集的１５４个稻瘟病菌菌株进行了遗传谱系和生理小种分析，以厘清贵州省稻瘟病菌主要菌株的遗传谱系的划分及遗传谱系与生理小种的关系。
　　１材料和方法
　　１．１供试菌株
　　自贵州各稻区采集水稻稻瘟病发病植株，带回实验室用单孢分离方法［９］获得稻瘟病菌的单孢菌株１５４个，各单孢菌株置于淀粉酵母培养基斜面上培养７～１０ ｄ后，采用液体完全培养基培养各菌株菌丝体。液体完全培养基配方为：Ｓｕｃｒｏｓｅ １０ ｇ；Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ ６ ｇ；Ｃａｓｉｎｅ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｈｙｄｒｅ ｌｙｓａｔｅ ６ ｇ；Ｖｏｇｅｌ’ＳＮ ４０ ｍＬ，加水定容至１ ０００ ｍＬ并调ｐＨ值至６．８～７．０。
　　培养菌丝体时，将斜面培养基上菌丝块转移到装有４０～５０ ｍＬ液体完全培养基的容量为１００ ｍＬ的三角瓶中，在摇床上培养（２４ ℃，１００～１２０ ｒ/min） ５～７ ｄ，待菌丝增殖至足够量时，用真空泵将菌丝体抽滤到滤纸上，然后将菌丝体转入５ｍＬ的离心管， －２０ ℃冰箱保存。
　　１．２稻瘟病菌全基因组ＤＮＡ提取
　　采用ＣＴＡＢ／ＮａＣｌ法提取稻瘟病菌全基因组ＤＮＡ。具体步骤如下：①菌丝体于冷冻干燥机上干燥２４ ｈ，加液氮研成菌丝粉；取干菌丝粉２０～３０ ｍｇ装入２ ｍＬ的Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ离心管，加提取缓冲液５００ μＬ，振摇混匀。缓冲液配比５０ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ－ＨＣＬ（ｐＨ值８．０）、１００ ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ、１５０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ。②在上述混合液中，加１０％ ＳＤＳ ５０ μＬ，将离心管横放，在摇床中轻摇１ ｈ（４０～５０ ｒ/min，３７ ℃）。③加５ ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ溶液７０ μＬ轻摇，使溶液充分混匀。④加１０％ ＣＴＡＢ溶液（１０％ ＣＴＡＢ溶于０．７ ｍｏｌ/Ｌ ＮａＣｌ中）６５ μＬ，在６５℃下水浴放置１０～２０ ｍｉｎ，其间轻摇数次。⑤加７００ μＬ氯仿、异戊醇混合液（体积比２４∶１），于摇床１５０ ｒ/min摇动５ ｍｉｎ；１０ ０００ ｒ/min离心１２ ｍｉｎ，取上清液装入新的ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ １．５ ｍＬ离心管中。⑥加入４５０ μＬ经预冷的异丙醇，－２０ ℃冷冻１ ｈ以上，１０ ０００ ｒ/min离心１２ ｍｉｎ，收集沉淀。⑦沉淀用７０％乙醇漂洗２次，风干后溶解于２００ μＬ ＴＥ缓冲液［１０ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ－ＨＣＬ（ｐＨ值７．５～８．０），１ ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ］中，此液即为ＤＮＡ样品。ＤＮＡ样品放置于－４０ ℃低温冰箱中保存。
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　　ＰＣＲ引物为稻瘟病菌基因组特异性的一对反向扩增引物Ｐｏｔ２－１（５′－ＣＧＧＡＡＧＣＣＣＴＡＡＡＧＣＴＧＴＴ
　　Ｔ－３′）和Ｐｏｔ２－２（５′－ＣＣＣＴＣＡＴＴＣＧＴＣＡＣＡＣＧＴＴＣ－３′），引物碱基序列由国际水稻研究所（ＩＲＲＩ）Ｌｅｕｎｇ Ｈ博士提供，由上海生工生物工程有限公司合成。ＰＣＲ反应体系为２５ μＬ，引物浓度为０．５ ｍｏｌ／Ｌ，１倍缓冲液［１０ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ（ｐＨ值９．２），２５ ｍｍｏｌ／Ｌ ＫＣＬ，１．５ ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ２，１５ ｍｍｏｌ／Ｌ （ＮＨ４）２ＳＯ４］，１８５ μｍｏｌ／ＬｄＮＴＰ，２．５ Ｕ Ｔａｇ酶，模板ＤＮＡ ５０ ｎｇ。ＰＣＲ扩增在ＰＴＣ－２００型扩增仪中进行，扩增循环为９５ ℃ ２．５ ｍｉｎ预变性；９４ ℃ １ ｍｉｎ，６２ ℃ １ ｍｉｎ，６５ ℃ ４ ｍｉｎ ４次循环；９４ ℃ ３０ ｓ，６２ ℃ １ ｍｉｎ，６５ ℃ ４ ｍｉｎ ２６次循环；６５ ℃ ５ ｍｉｎ。完毕后４ ℃保存待检。
　　１．４检测与分析
　　取扩增产物１０ μＬ，加２ μＬ点样缓冲液（０．２５％溴酚兰，４０％蔗糖水溶液），混匀，点入０．５％琼脂糖＋０．７５％ ＳｙｎｅｒｇｅｌＴＭ（Ｄｉｖｅｒｓｉｆｉｅｄ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｎｅｗｔｏｎ，ＭＡ）凝胶孔中。０．５×ＴＢＥ缓冲液１２０ Ｖ稳定电压电泳７ ｈ，０．５ μｇ／ｍＬ的ＥＢ染胶２０ｍｉｎ，凝胶成像系统照相存盘（图１）。为确定菌株间的遗传关系，将谱带的有无转换为二进制数据（１代表有，０代表无），然后应用唐启义等［１０］的ＤＰＳ软件分析法对供试菌株扩增谱带进行聚类分析。
　　１．５稻瘟病菌的生理小种测定
　　按中国稻瘟病菌生理小种统一鉴定标准，应用全国稻瘟病菌生理小种联合试验组的７个中国鉴别品种［１１］，测定１５４个供试菌株的致病型。水稻种子经浸种催芽后，播于育苗盘内，于幼苗３～４叶期接种，接种液每毫升中含（２～３）×１０５个稻瘟病菌孢子。
　　接种后的植株在２６ ℃±１ ℃和高湿条件下保持１６～２０ ｈ，然后移入２７ ℃±１ ℃和高湿的温室中，７ ｄ后按Ｒ、Ｍ、Ｓ标准进行调查［１２］。
　　２结果与分析
　　２．１供试菌株ｒｅｐ－ＰＣＲ扩增结果
　　应用ＤＰＳ分析软件［１０］对供试菌株ＰＣＲ扩增谱带进行聚类分析。结果（图２）表明，在欧氏距离（Ｅｕｃｌｉｄｅａｎ ｄｉｓｔａｎｃｅ）３．８５遗传相似水平处，可把１５４个菌株（谱带２条以上）划分为１２个遗传谱系 （遗传相似组）。在１２个遗传谱系中，第一、六、五、八为优势谱系，第一谱系有２５个菌株，第六谱系有２０个菌株，第五谱系有１７个菌株，第八谱系有１６个菌株，分别占总菌株数的１６．２％、１３．０％、１１．０％、１０．４％；第二、四、七、十二、三、十一、九谱系分别有１３、１３、１２、１１、９、８、７个菌株；第十谱系仅有３个菌株（表１）。
　　２．２稻瘟病菌菌株遗传谱系与生理小种关系
　　参试的１５４个稻瘟病菌菌株可分为６群２１个小种，即ＺＢ１、ＺＢ３、ＺＢ５、ＺＢ９、ＺＢ１３、ＺＢ１５、ＺＢ１７、ＺＢ２１、ＺＢ２３、ＺＢ２７、ＺＢ２９、ＺＣ１、ＺＣ５、ＺＣ７、ＺＤ１、ＺＤ３、ＺＤ５、ＺＥ１、ＺＥ３、ＺＦ１和ＺＧ１（表１）。其中ＺＢ群为优势种群，出现频率４７．４％。ＺＢ１小种和ＺＢ１３小种为优势小种，出现频率分别为１６．９％、１４．９％。
　　稻瘟病菌菌株遗传谱系与生理小种间并不存在较严格的对应关系。同一遗传谱系可由多个不同的生理小种菌株组成，如在第一谱系中同时出现生理小种为ＺＢ１、ＺＢ１５、ＺＣ１、ＺＤ１、ＺＦ１、ＺＧ１的菌株；而同一生理小种菌株亦可分属不同的遗传谱系，如同属生理小种ＺＢ１的菌株既出现在第一谱系，又出现在第二、三、四、五等多个遗传谱系中。
　　３结论与讨论
　　稻瘟病菌遗传谱系研究表明，在贵州省采集的１５４个菌株分属于１２个遗传谱系，其中第一、六、五、八为优势谱系。用中国稻瘟病菌生理小种统一鉴别品种可将１５４个参试菌株分为６群２１个小种。分析发现稻瘟病菌菌株遗传谱系与生理小种间并不存在一一对应关系，同一遗传谱系可由多个不同的稻瘟病菌生理小种菌株组成，如属于生理小种为ＺＢ１、ＺＢ１３、ＺＧ１、ＺＦ１、ＺＤ１、ＺＢ３、ＺＢ１５、ＺＣ１、ＺＥ１、ＺＤ５、ＺＢ２１的菌株都存在于第一遗传谱系中；同一生理小种菌株亦可分属于几个不同的遗传谱系，如生理小种ＺＢ１的菌株既出现在第一谱系，又出现在第二、三、四、五、六等遗传谱系中。可见，应用全国统一的７个稻瘟病鉴别品种对稻瘟病菌株进行的生理小种的分类，并不能准确地反映出贵州省稻瘟病菌的遗传特征。分子指纹分析技术有助于在ＤＮＡ水平上反映稻瘟病菌遗传多样性的实质，便于更准确地掌握稻瘟病病原菌的遗传变异信息，利于指导开展水稻持久抗稻瘟病育种工作，并可为具有不同遗传背景水稻品种在种植中的合理布局提供理论依据。
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　　注：本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文
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