三种小麦蛋白质测定方法的比较|小麦蛋白质含量测定

　　摘要：为比较不同小麦蛋白质测定方法，总结各方法的特点和适用条件，该试验用凯氏定氮法、近红外透射光谱分析法和考马斯亮蓝染色法分别对１４个小麦品种进行蛋白质含量的测定。结果显示，三种方法都能测定出各材料的蛋白质含量，在９５％置信区间，凯氏定氮法和近红外透射光谱分析法测定值与常年平均值之间存在线性关系，三者测定结果之间没有显著差异。
　　关键词：凯氏定氮法；近红外透射光谱分析法；考马斯亮蓝染色；蛋白质；测定
　　中图分类号：Ｓ５１２．１；Ｓ３３１文献标志码：Ａ文章编号：0439－８114（２０11）12－2533-03
　　
　　Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ 3 Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｔｏｗａｒｄｓ Pｒｏｔｅｉｎ ｉｎ Ｗｈｅａｔ
　　
　　ＪＩ Ｙｕ－ｍｅｉ
　　（Ｈｅｂｉ Ｖｏｃａｔｉｏｎａｌ ＆ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ， Ｈｅｂｉ ４５８０３０， Ｈｅｎａｎ， Ｃｈｉｎａ）
　　
　　Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔhe ｔｈｒｅｅ ｋｉｎｄｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ， ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｋｊｅｌｄａｈｌ， nｅａｒ ｉｎｆｒａｒｅｄ ｔｒａｎｓｍｉｔｔａｎｃｅ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ （ＮＩＴＳ） ａｎｄ Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ ｂｒｉｌｌｉａｎｔ ｂｌｕｅ ｓｔａｉｎｉｎｇ， ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ｔｏ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ 14 kinds of ｗｈｅａｔ ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅｌｙ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ａｌｌ ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄｓ ｗｅｒｅ ｆｅａｓｉｂｌｅ， ａｎｄ ｔｈｅ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ａｖｅｒａｇｅ ａｎｎｕａｌ ｖａｌｕｅｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｆｒｏｍ Ｋｊｅｌｄａｈｌ ａｎｄ ｎｅａｒ ｉｎｆｒａｒｅｄ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ ｔｈｅ ９５％ ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ ｉｎｔｅｒｖａｌ was linear． Ｎｏ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ａｍｏｎｇ ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｔｈｒｅｅ ｍｅｔｈｏｄｓ ｗａｓ ｏｂｓｅｒｖｅｄ．
　　Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Kｊｅｌｄａｈｌ； ＮＩＴＳ； Cｏｏｍａｓｓｉｅ bｒｉｌｌｉａｎｔ bｌｕｅ； ｐｒｏｔｅｉｎ； ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ
　　
　　小麦作为重要的农作物，其品质差异可显著影响其经济价值。蛋白质含量是衡量小麦加工品质的重要指标，通常采用具有较高准确度和精密度的用凯氏定氮法来测定［１－２］，但该法费时费工，其使用的试剂为强酸强碱，对环境污染较大［３－４］。近年来，近红外透射光谱技术已广泛应用于谷物子粒的品质分析和育种筛选［５－６］，例如：瑞典Ｐｅｒｔｅｎ公司的ＤＡ７２００近红外仪能在天然物理状态下，对谷物实现快速无损地定性定量分析［７］；考马斯亮蓝染色法是经典的蛋白质测定方法，通过测定５９５ ｎｍ处光吸收的增加量来计算与染料结合的蛋白质量，具有反应快、灵敏度高的优点［８］。本试验通过分析比较凯氏定氮法、近红外透射光谱分析法和考马斯亮蓝染色法测定小麦中的蛋白质含量，确定各种方法的适用条件，为探索小麦育种早期材料的蛋白质测定提供有效分析方法。
　　１材料和方法
　　１．１材料
　　选择蛋白质含量差异分布较大的１４个小麦品种，包括：轮选９８７、轮选３２６、轮选２０９、轮选９７９、新１１试管株、新麦１１、豫麦４７、豫麦３４、罗夫林、杨麦１３、杨麦００１－１８、周麦１６、百农３２１７和百农矮抗５８。
　　本实验所用试剂均为分析纯试剂，实验用水为去离子水。
　　凯氏定氮法使用试剂包括：硫酸钾、硫酸铜、硫酸、２０ ｇ／Ｌ硼酸溶液、４００ ｇ／Ｌ氢氧化钠溶液，０．０５ ｍｏｌ／Ｌ ＨＣｌ标准溶液，１ ｇ／Ｌ甲基红乙醇溶液，１ ｇ／Ｌ亚甲基蓝乙醇溶液和１ ｇ／Ｌ溴甲酚绿乙醇溶液。临用前配制２份甲基红乙醇溶液与１份亚甲基蓝乙醇溶液混合指示液。
　　考马斯亮蓝溶液：称取０．１０ ｇ考马斯亮蓝Ｇ２５０，溶于５０ ｍＬ ９５％（Ｖ／Ｖ）乙醇后，加入１００ ｍＬ ８５％（Ｖ／Ｖ）磷酸，并用去离子水稀释至１ ０００ ｍＬ，滤纸过滤，待用。２０ ｇ／Ｌ氯化钠溶液，５ ｇ／Ｌ氢氧化钠溶液，７０％（Ｖ／Ｖ）乙醇溶液。
　　１．２方法
　　所有材料种植在本单位试验田，正常收获、测产、脱粒和保存，采用四分法选取各品种的实验材料。每个样品设平行样３个，结果取平均值计算。通过ＳＰＳＳ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ １７．０软件进行相关性分析。
　　１．２．１凯氏定氮法测定蛋白质含量称取充分混匀的试样０．５ ｇ，精确至０．００１ ｇ，移入干燥的２５０ ｍＬ定氮瓶中，加入０．２ ｇ硫酸铜、６.0 ｇ硫酸钾及２０ ｍＬ硫酸，加热后，炭化全部内容物，并保持瓶内液体微沸，至液体呈蓝绿色并澄清透明后，再继续加热０．５ ～１ ｈ。取下放冷，小心加入２０ ｍＬ水。移入１００ ｍＬ容量瓶中，并用少量水洗定氮瓶，洗液并入容量瓶中，定容至刻度，混匀备用，同时设置空白对照。再向水蒸气发生器内加水至２／３处，加入数粒玻璃珠、甲基红乙醇溶液数滴后，加热煮沸并保持沸腾。并在接收瓶内加入１０．０ ｍＬ硼酸溶液及１～２滴混合指示液，使冷凝管的下端插入液面下。分别吸取２．０ ｍＬ试样处理液和10 ｍＬ水注入反应室，随后塞紧棒状玻塞。缓慢滴加１０．０ ｍＬ氢氧化钠于反应室中，蒸馏 １０ ｍｉｎ后移动蒸馏液接收瓶，液面离开冷凝管下端，再蒸馏 １ ｍｉｎ。冷却后，取下蒸馏液接收瓶。以盐酸标准溶液滴定至终点。同时作试剂空白。
　　按照下式计算蛋白质含量：
　　Ｘ＝×Ｆ×１００
　　Ｘ――试样中蛋白质的含量（单位：ｇ／１００ ｇ）；
　　V1――试液消耗盐酸标准滴定液的体积（单位：ｍＬ）；
　　V2――试剂空白消耗盐酸标准滴定液的体积（单位：ｍＬ）；
　　V3――吸取消化液的体积（单位：ｍＬ）；
　　ｃ――盐酸标准滴定溶液浓度（单位：ｍｏｌ／Ｌ）；
　　０．０１４ ０――１．０ ｍＬ １．０００ ｍｏｌ／Ｌ盐酸标准溶液相当的氮的质量（单位：ｇ）；
　　ｍ――小麦粉的质量，（单位：ｇ）；
　　Ｆ――小麦的蛋白质含量换算系数５．７０
　　１．２．２ＤＡ７２００近红外分析仪测定蛋白质含量利用瑞士Ｐｅｒｔｅｎ公司生产的ＤＡ７２００近红外仪测定，小麦近红外校准曲线由中国农业部谷物品质监督检验测试中心建模，结果由系统软件自动分析。
　　１．２．３考马斯亮蓝染色法测定蛋白质含量取０．３ ｇ小麦粉于研钵中，加少许二氧化硅研磨，取３ ｍＬ水分两次洗研钵后转入１０ ｍＬ离心管中。超声振荡１０ ｍｉｎ后，１２ ０００ ｒｐｍ离心１０ ｍｉｎ，取上清液于另一试管中，沉淀重复用水超声提取，离心后，合并上清。取０．１ ｍＬ提取液，加入０．９ ｍＬ水和５ ｍＬ考马斯亮蓝Ｇ２５０，染色３ ｍｉｎ后在５９５ ｎｍ处测吸光值。另取取６支１０ ｍＬ干净的具塞试管，按表１制备梯度浓度的标准溶液，加考马斯亮蓝Ｇ２５０显色３ ｍｉｎ后，同条件测定其ＯＤ５９５ ｎｍ，制备标准曲线。根据标准曲线计算小麦样品中的蛋白质含量。
本文为全文原貌 未安装PDF浏览器用户请先下载安装 原版全文 　　２结果与分析
　　表２为１４个样品常年平均值（前５个为测试样品，没有常年平均值）和三种方法测定蛋白质含量结果，表３、表４为在９５％置信区间时三种测定方法与常年平均值相关性的比较。
　　上述结果表明，三种蛋白质测定方法都能测定出小麦中的蛋白质含量。从表３可知，凯氏定氮法和近红外光谱分析法在９５％置信区间显著性系数都小于０．０５，表明两种方法与常年平均值之间存在线性关系。从表４可知，凯氏定氮法和近红外光谱分析法在Ｔ检验结果中，显著性概率大于０．０５，这说明两种方法测定的蛋白质含量与常年平均值之间不存在显著性差异，可以真实的体现出被测样品的蛋白质水平。但另一方面，考马斯亮蓝染色法的测定值与常年平均值之间相关性不强，这可能是操作误差引起的，也可能是与该参考值的测定方法不同所导致，还可能是考马斯亮蓝染色法仅对微量蛋白测定罗为准确有关［９］。
　　３讨论
　　凯氏定氮法测试结果虽然准确可靠，但该法所需仪器多为特制玻璃仪器，蒸馏与吸收装置复杂，易破损，难操作和维护［１０］，而且整个过程耗时约７～８ ｈ，操作繁琐，试剂消耗量大且排放物污染环境。特别是该方法测定后，样品无法回收，因此，该方法并不适合于分析较为珍贵的样品。采用近红外光谱分析法分析样品的耗时为１０～２０ ｍｉｎ，分析效率高，适用的样品范围广，样品勿需处理、３０～４０ ｇ种子即可用于分析，分析成本低，测试重现性好，属于无损检测，非常适合于育种过程中的早代种子鉴定和筛选大量中间材料［１１－１２］。考马斯亮蓝染色法快速、灵敏，但只对微量蛋白有较好的测定线性范围，因此在实验前应将样品的蛋白浓度稀释为０．１～１．０ ｍｇ／ｍＬ，而且实验必须在１ ｈ内完成，否则测试结果不准确［１３］。
　　总之，通过分析上述３种蛋白质的测定方法的原理和特点，并结合本实验的分析结果，对实际样品分析方法的选择和应用分析具有重要的指导意义。
　　参考文献：
　　［１］ 陈智慧，史梅，王秋香，等． 用凯氏定氮法测定食品中的蛋白质含量［Ｊ］．新疆畜牧业，２００８（５）：２２－２４．
　　［２］ ＧＢ／Ｔ ５５１１－２００８．谷物和豆类 氮含量测定和粗蛋白质含量计算 凯氏法［Ｓ］．
　　［３］ 陶娜，罗松明，张奎，等． 小麦品质指标及蛋白质测定方法比较［Ｊ］． 粮食储藏，２００7（１）：３６－３９．
　　［４］ 陆晓滨，李敬龙，董贝磊，等． 提高凯氏定氮法蛋白质测定速度的研究［Ｊ］．中国调味品，２００３（１）：３７－３９．
　　［５］ 杨小红，郭玉秋，傅�，等． 利用近红外光谱法分析玉米籽粒脂肪酸含量的研究［Ｊ］． 光谱学与光谱分析，２００９，２９（１）：１０６－１０９．
　　［６］ 杨 敏，宋晓锐，罗宗铭．蛋白质分析方法的新进展［Ｊ］．广州化工，２０００，２８（４）：１２１－１２３；１１４．
　　［７］ 王林友，王建军，张冬青，等． 近红外漫反射光谱法对粮油作物品质无损分析的研究［Ｊ］．浙江农业学报，２００２，１４（２）：１０５－１11．
　　［８］ 李娟，张耀庭，曾伟，等． 应用考马斯亮蓝法测定总蛋白含量［Ｊ］． 中国生物制品学杂志，２０００，１３（２）：１１８－１２０．
　　［９］ 李宁． 几种蛋白质测定方法的比较［Ｊ］． 山西农业大学学报（自然科学版），２００６，２６（２）：１３２－１３４．
　　［１０］ 王雅． 蛋白质测定实验的研究［Ｊ］． 实验室研究与探索，２００５，２４（４）：５８－５９．
　　［１１］ 魏良明，严衍禄，戴景瑞． 近红外反射光谱测定玉米完整籽粒蛋白质和淀粉含量的研究［Ｊ］． 中国农业科学，２００４，３７（５）：６３０－６３３．
　　［１２］ 李冬梅，田纪春． 小麦面粉蛋白质含量测定方法的比较［Ｊ］． 湖北农业科学，２００９（３）：７１５－７１７．
　　［１３］ 高崧，刘秀梵，张如宽． 蛋白质分析中ＳＤＳ－ＰＡＧＥ银染法与考马斯亮蓝染色法敏感性的比较［Ｊ］． 江苏农学院学报，１９９５，１６（２）：３０－３０，７２．
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