棉花黄萎病拮抗菌的筛选及定殖效果初步研究_棉花黄萎病

　　摘要：对１２０株棉花内生菌对棉花黄萎病菌（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｄａｈｉｌａｅ）的抑制作用进行了研究，筛选出能够对病原菌产生抑制或拮抗作用的菌株。发现１5．8％的菌株对病原真菌有一定拮抗作用，具有强拮抗作用的菌株有３株，选取拮抗作用最强的Ｓ１１菌株进行棉苗入侵定殖效果研究，结果显示，采用菌液浇灌的方式，能从棉苗的根、上胚轴、下胚轴和子叶中分离发现菌株，在４种接种方式中菌株定殖效果最好。
　　关键词：拮抗菌；棉花黄萎病；筛选；定殖
　　中图分类号：Ｓ４３５．６２１ 文献标识码：Ａ 文章编号：0439－８114（２０11）09－1800-03
　　
　　Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ for Antagonistic Strains Against Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｄａｈｉｌａｅ ａｎｄ Pｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ Sｔｕｄｙ on the Cｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ Eｆｆｅｃｔ
　　
　　ＦＡＮ Ｙｕ－ｇａｎｇ，ＷＡＮＧ Ｍｉ，ＷＡＮＧ Ｗｅｉ－ｄｏｎｇ，ＬＩＵ Ｎｉａｎ
　　（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ，Ｙａｎｇｔｚｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｊｉｎｇｚｈｏｕ ４３４０２５，Ｈｕｂｅｉ，Ｃｈｉｎａ）
　　
　　Ａｂｓｔｒａｃｔ： Aｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ ｂａｃｔｅｒｉum ｗｅｒｅ ｓｃｒｅｅｎｅｄ out ｏｆ １２０ entophyte ｓｔｒａｉｎｓ ｆｒｏｍ ｃｏｔｔｏｎ． Ｉｔ ｗａｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ １5.8% ｏｆ ｔｈｅｓｅ ｓｔｒａｉｎｓ ｈａd ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ， among which ｔｈｒｅｅ ｓｔｒａｉｎｓ ｈａd ｇｏｏｄ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ． Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ ｂａｃｔｅｒｉａ Ｓ１１ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｂｅｓｔ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｗａｓ ｓｔｕｄｉｅｄ ｉｎ ｃｏｔｔｏｎ ｉｎｖａｓｉｏｎ ａｎｄ ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ. Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ bａｃｔｅｒｉａ lｉｑｕｉｄ ｉｒｒｉｇａｔｉｏｎ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈe ｂｅｓｔ ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｅｆｆｅｃｔ ｉｎ ｃｏｔｔｏｎ. Ｔｈｅ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｃｏｕｌｄ be ｓｅｐａｒａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｒｏｏｔｓ， ｅｐｉｃｏｔｙｌ， ｈｙｐｏｃｏｔｙｌ ａｎｄ ｃｏｔｙｌｅｄｏｎ ｏｆ ｃｏｔｔｏｎ． Among the 4 inoculation mehtod， fix planting has bdst efficiency.
　　Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ； Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｄａｈｉｌａｅ； ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ； ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ
　　自１８９８年Ｖｏｇｌ从黑麦草种子内分离出第一株内生真菌以来，植物内生菌作为一种新的微生物资源受到了广泛的关注，从内生菌中寻找和发现新的活性化合物已成为国内外研究的又一热点。近年来，该领域的研究已取得一定进展，发现了一些有医用、农用价值的菌株和化合物［１］。
　　棉花黄萎病属于土传病害，防治极为困难。目前防治棉花黄萎病的物理、化学方法的效果都不理想，采用生物防治棉花黄萎病逐步取得较好的效果，且对环境无污染。利用生防菌的拮抗作用可以有效地抑制致病菌的生长，内生拮抗菌定殖于植物体内，作为生防菌有极大的优势［２］。从棉花组织中分离筛选到一株具有强拮抗作用的菌株Ｓ１１，用不同的方法将其接种到棉苗上，研究不同入侵途径的定殖效果，以期为棉花黄萎病的生物防治提供有效参考。
　　１材料与方法
　　１．１材料
　　１．１．１供试菌株供试内生菌菌株：采用表面消毒后稀释磨平板的方法从湖北荆州棉株样品中分离出１２０株内生菌株（表１）。病原真菌：棉花黄萎病菌（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｄａｈｉｌａｅ）菌株由南京农业大学实验室提供。
　　１．１．２仪器与药品仪器：千分尺，移液枪，打孔器，药匙，高压蒸汽灭菌锅，电热恒温鼓风干燥箱，水浴锅，隔水式恒温培养箱，生化培养箱，恒温摇床，离心机，育苗盘等；培养基：ＰＤＡ培养基、ＰＤ液体培养基、ＮＡ培养基；灭菌无土育苗混配基质（专利号２００７１００５３５８３．４）；棉花种子：鄂杂棉１０号棉子。
　　１．２方法
　　１．２．１平皿对峙法采用平皿对峙培养法进行内生菌和病原真菌间的皿内拮抗试验［３］。在ＰＤＡ平板上以原点为中心划垂直的十字，分别将病原真菌和内生菌沿一条直线等距离接种于平板两侧，以中央只接种病原真菌的平板为对照（ＣＫ）。放于培养箱中２８ ℃培养，２～７ ｄ后观察菌落生长情况。并测定抑菌带宽度。将抑菌带宽度大于10 ｍｍ作为强抑菌作用菌株（＋＋＋），抑菌带宽度为５～10 ｍｍ作为中强抑菌作用菌株（＋＋），抑菌带宽度小于５ ｍｍ作为弱抑菌作用菌株（＋）。
　　１．２．２生长速率法将初选拮抗菌株接种于ＮＡ培养液中，２５ ℃条件下置转速１４０ ｒ／ｍｉｎ的摇床上培养３～６ ｄ，将培养液１０ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心３０ ｍｉｎ，取上清发酵液。将发酵液以体积比１∶１0加入ＰＤＡ培养基中制成平板（直径９０ ｍｍ），以加等量无菌水的平板为对照，用打孔器在平板中央接种病原菌菌饼，菌饼直径５ ｍｍ，２５ ℃下培养４ ｄ，测量各处理菌落直径，计算各菌株发酵液对病原菌的抑制率［４］。
　　内生菌对病原菌的生长抑制率＝（对照菌落半径Ｒｃ－处理菌落半径Ｒｐ）／对照菌落半径Ｒｃ×１００％
　　１．２．３菌株的接种方法将筛选出的拮抗作用最强的菌株，移至ＮＡ培养液中，３０ ℃下振荡培养２ ｄ，用无菌水配成１０８ ＣＦＵ／ｍＬ的菌体悬浮液，备用［５］。①浸种接种：将棉花种子浸入３０ ℃的菌体悬浮液中６ ｈ，播种在灭菌的棉花无土育苗基质中；②浇灌接种：用菌体悬浮液按３０ ｍＬ／株的量淋到苗根部和育苗基质中；③喷雾接种：棉种出苗后，用喷雾器将菌体悬浮液按２ ｍＬ／株的量均匀喷洒到棉苗叶面上；④针刺接种：分别用大头针将棉苗植株的茎和叶部刺伤，蘸上筛选出的菌体悬浮液。按以上接种方法接种后均放置在温光培养箱内３０ ℃环境中生长。每处理３次重复，各试验均以灭菌水作为相应对照。
　　１．２．４接种菌的回收分别剪取以不同接种方法接种的棉苗植株４个部位各５ ｇ，灭菌水冲洗干净，剪成５ ｍｍ × ５ ｍｍ的组织块，在体积分数为７５％的酒精中浸泡１ ｍｉｎ，然后用质量分数为０．１％的升汞消毒３ ｍｉｎ，灭菌水冲洗３次，取消毒后最后一次冲洗液１ ｍＬ置于灭菌培养皿中，倒入４５ ℃的ＮＡ培养基，充分摇匀。２８ ℃下培养３ ｄ，观察有无菌落产生，验证消毒是否将供试材料表面的微生物全部杀死。将供试材料于灭菌的研钵中研磨，用无菌水稀释成１０－２、１０－３和１０－４的浓度，分别移取１ ｍＬ，倒入４５ ℃含有２００ μｇ／ｍＬ链霉素的ＮＡ培养基，充分摇匀后在２８ ℃下培养３ ｄ，经生理生化测定和棉花黄萎病的拮抗测定以确定其是否接种的目标菌株。
　　２结果与分析
　　２．１棉花内生菌对病原菌的抑制效果
　　通过对１２０株内生菌与病原菌的对峙培养，其中有１９株内生菌表现出一定的抑制作用，占到供试菌株的15.8％。其中抑菌带宽度最小的为１．５ｍｍ，抑制作用最小；产生抑制作用的菌株中大多为中等抑菌强度；抑菌带宽度较大的菌株有Ｓ３、Ｓ１１和Ｒ２０，分别达到了１１．５、１０．５和１０．０ ｍｍ，抑菌作用较强（表２）。其他菌株因没有明显的抑菌带，故未列入表２中。
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　　对初选出的１９个内生菌发酵液的抑菌活性测定结果表明，所有发酵液处理的病原菌菌落直径均小于空白对照，说明其对棉花黄萎病菌都有明显的抑制作用。各菌株抑制率在２１．１％～９１．０％。试验菌株Ｌ９发酵液抑菌率为２１．１％，抑菌活性较差；菌株Ｓ３和Ｒ２０抑菌活性较强，抑菌率分别达到89.6%和88.2%；菌株Ｓ１１、Ｒ２７抑菌活性都达到了９０％以上，对病菌的抑制作用明显强于其他菌株，其中Ｓ１１的抑菌活性最佳（表３）。
　　２．３菌株的定殖效果
　　结果表明，Ｓ１１菌株均可通过这４种接种方法入侵定殖于棉苗。经浸种、浇灌和针刺处理的棉苗植株，其根部、上下胚轴均发现有Ｓ１１菌株存在，其中，根部菌量较多，上胚轴和下胚轴菌量较少，叶片（包括子叶）没有发现Ｓ１１菌株；喷雾处理的棉苗除了叶上存在少量菌株外，其他部位没有发现菌株的存在。浇灌处理根部菌量较大，浸种处理的根部菌量中等，说明根部是容易被内生拮抗菌入侵定殖的部位。试验结果表明，Ｓ１１菌株可以通过浸种的方式定殖，也可以通过棉苗的根、上下胚轴、叶表皮进入植株内（表４）。
　　３结论与讨论
　　３．１结论
　　经过皿内拮抗试验，从棉株样品中所分离的１２０株菌株中有１９株对棉花黄萎病菌有拮抗能力。即有１5．8％的菌株对病原真菌有一定拮抗作用，有强拮抗作用的菌株有３株，其中菌株Ｓ１１对棉花黄萎病菌的抑制率达到９１．０％。
　　对菌株Ｓ１１进行入侵棉株定殖效果试验，发现用浸种、浇灌、喷雾、针刺等方法把菌株接种到棉苗，均能从棉苗的根、上胚轴、下胚轴和叶中发现菌株，其中浇灌的效果最佳，其次是浸种以及针刺效果。用喷雾处理只在叶中有少量菌株，效果较差。
　　３．２讨论
　　本研究只是初步在数量上测定了对棉花黄萎病有抑制作用的内生菌株，所分离出的内生菌生理生化特征未进行测定，且内生真菌对病原菌产生拮抗作用的化学物质也需进一步分离分析。试验用浸种、浇灌处理的棉花植株，不但从根部分离到目标菌株，从棉苗植株的上下胚轴和叶部也分离到该菌；而用针刺接种的植株可以从根部分离到Ｓ１１菌株，说明该菌能在棉苗植株的不同部位相互转移，但是转移的方式及原因有待进一步探讨；一般认为，内生菌只有在植株发生创伤时，才能入侵定殖［６］，但本试验所用无土基质经过灭菌处理，排除了基质中病虫害造成的外伤所致内生菌入侵，棉花苗期取样时并未发现创伤，而检测结果却显示内生菌已入侵定殖，具体原因需进一步研究。
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