[长梗蕉ＳＳＲ标记的研究] 天之蕉子什么梗

　　摘要 以云南野蕉（Musa.bilbisiana Colla）为实验材料，应用选择性扩增微卫星（SAM）法分离、克隆50个DNA序列，其中20个非重复，可用。一共20个序列用于特异引物的设计，再从20个序列的23个基因座设计出23对特异引物。研究表明：所采用的开发SSR标记的方法不仅简便、效率高且成本低。此外，5′锚定引物的简并性，引物与设计的特异引物配对后，部分引物对在进行检测时扩增得到的条带不清晰且稳定性较低。
　　关键词 长梗蕉；香蕉；SSR标记；SAM法
　　
　　随着分子标记技术的出现，国内已有人采用RAPD、AFLP技术来研究香蕉品种的亲缘关系，而香蕉的SSR标记尚无相关的研究报道。与其他分子标记技术相比，SSR标记多态性主要依赖于基本单元重复次数的变异，而这种变异在生物群体中是大量存在的，并且其具有使用程序简便、快速、多态性高、重复性好、遗传信息量大、共显性遗传等特点，是进行群体遗传结构分析、构建遗传连锁图谱非常有效的工具。目前许多物种已有现成的SSR引物，对一般实验室而言，只需合成现有的SSR引物进行PCR扩增，即可分析DNA的多态性。但因为SSR标记具有种族特异性，必须采用特异引物进行PCR检测，故而存在一个引物开发的问题。
　　开发SSR引物的方法有几种：经典的筛选基因组文库的方法、微卫星富集法、STMS（sequence tagged microsatellite sites）、选择性扩增微卫星（selectively amplified microsatellite，SAM）等。其中，SAM是研制SSR标记的一种新方法，不仅能产生多基因座SSR指纹，而且有用的SSR的回收率高，只需合成1个特异引物，即可检测相应的多态性SSR基因座。与传统方法相比，操作过程简便，成本也大大降低，故以此方法为本研究的首选方法。
　　
　　1材料与方法
　　
　　1.1植物材料
　　以云南野蕉（M.BB Group Yunnanyejiao)为实验材料，由徐碧玉副研究员课题组提供。
　　1.2所用试剂
　　大肠杆菌（Escherichia coli）菌株DH5α由本实验室保存。限制性内切核酸酶MseⅠ购自Biolabs公司；PstⅠ、dATP、ExTaq酶、T4ligas购自宝生物工程（大连）有限公司；pBS-T vector和UNIQ210柱式PCR产物纯化试剂盒购自Tigangen公司；Taq DNA polymerase购自Fermentas公司；所用接头、suppressor primer，adapter primer和5′锚定简并SSR Priner，其序列参照Hayden MJ等人的方法，由北京奥科生物技术服务有限公司合成。
　　1.3方法
　　1.3.1香蕉基因组DNA的提取与纯化。香蕉叶片基因组DNA提取参照CTAB法，提取的DNA采用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计Eppendorf Biophotometer分析测定，待用DNA样品稀释至20 ng/μL后，置-20℃保存备用。
　　1.3.2SSR序列的分离。应用Hayden和Sharp的选择性扩增微卫星（SAM）法，从云南野蕉的基因组DNA中分离SAM片段，经回收、克隆、测序后，用SSR FINDER软件分析，获得SSR序列。引物的设计与合成：采用PrimerPremier5.0软件设计特异引物，引物设计参数为引物长度（15~25nt）、3′端稳定性（-5.5~-9.0kcal/moL）、引物Tm值（52～65℃）、C含量（45%~55%）、引物rating值（＞90）。引物设计完成之后，由上海生物工程技术服务有限公司合成。
　　1.3.3不同引物的Tm值的筛选及多态性引物的筛选。以云南野蕉的基因组DNA为模板，更换不同的特异引物，进行退火温度梯度筛选。PCR反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性1min，48～58℃退火1min，72℃延伸45s，35个循环，最后72℃延伸5 min 。退火温度梯度设置分别为：48.0℃，48.7℃，49.6℃，50.7℃，52.0℃，53.4℃，54.8℃，56.1℃，57.1℃，58.0℃。PCR产物经8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，银染方法参考张军等的方法。
　　
　　2结果与分析
　　
　　2.1SSR序列的分离
　　2.1.1SAM片段的分离、克隆与测序。以云南野蕉基因组DNA为底物进行MseⅠ+PstⅠ双酶切，酶切产物与接头连接之后通过抑制性PCR、预扩增和SAM 3轮扩增，然后进行5%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，将SAM产物分离开来，银染结果显示：12个泳道中，每个泳道都有3~10条清晰的带，大小在100~700bp之间，从所有的泳道中共回收到61个大小不同的SAM扩增片段。但由于在2次SAM中，检测显示小于250bp的条带不利于以后引物的设计，因此在2次SAM中只挑选了50个大小≥250bp的条带进行克隆。总共克隆了50个SAM片段用于测序，其中，28个片段测序结果不好，2个片段序列重复，最后只有20个片段序列各不相同，可用。
　　2.1.2SSR FINDER分析结果。用SSR FINDER软件对上述20个测序片段进行分析，结果显示：所有片段都含有SSR序列。其中，测序片段含有二核苷酸重复占52.6%，其中CA/AC重复和GT/TG重复的各有6个，且重复数为6～10个，最多的达到15个CA重复，测序片段的编号为ACP2-1，微卫星序列长达30nt。而含有二核苷酸CT/TC重复的有5个，重复数均为6个。除了二核苷酸重复之外，也有部分序列中还含有三核苷酸重复、四核苷酸重复和五核苷酸重复。如编号为CTP1-1的片段含（CTT）14、编号为GTP3-7的片段含（CATAC）3。有1个片段含有复合SSR序列，即编号为CTP1-3的片段含（CT）6（CA）10。另外，有7个片段含间隔SSR序列，如编号为GTP3-6的片段（CTT）2C（CTT）2，分析了20个序列，每个序列都含有1~3个SSR序列。
　　2.1.3特异引物的设计。根据20个DNA片段中所含的SSR两端的侧翼序列采用PrimerPremier5.0软件设计特异引物。在20个片段中共找到28个不同的SSR位点，其中有5个位点因形成引物间二聚体、发夹结构或发生错配的概率比较高而找不到合适的引物。最后，从20个片段中所含的23个SSR位点的两侧设计出特异引物23对，分别对23对基因座进行检测。23对引物编号为MBC001、MBC002……MBC0023。
　　2.1.4有用引物的筛选。用上述23对引物对云南野蕉基因组DNA进行扩增，结果显示：引物编号为MBC001的没有扩增出条带。MBC002、MBC004、MBC005、MBC006、MBC007、 MBC008、MBC009、MBC010、MBC011、MBC012、MBC013、MBC015、MBC016、MBC018、MBC020和MBC021这16对特异引物，均扩增出与预期大小相符的主带；MBC003、MBC014、MBC017、MBC019、MBC022和MBC023这6对特异引物扩增出的主带虽然与预期大小不符合，但均能重复出现，所以仍把它们作为有用引物继续检测其多态性（见表1）。
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　　3讨论
　　
　　3.1SAM法产生SSR位点的频率
　　本研究所获得的含SSR位点的测序片段中，二核苷酸（CA/AC）n和（GT/TG）n的重复位点最多，与Hayden M.J所获得的结果一致，但在许多报道中，（GA）n重复广泛存在植物基因组中，如Rivera R等在椰子SSR标记开发研究中，得到的二核苷酸重复占所有位点重复的64%，其中二核苷酸重复有三类：GA/CT、CA/GT、GC/CG，比例分别为40%、23%和1%。Viruel M.A等在荔枝SSR标记开发中得到最多的SSR重复位点也是（CT）n/（GA）n，占71.5%。出现这样不同的结果，原因可能是所用的方法不同而致。笔者发现，在一些报道中，用含不同的SSR序列的寡核苷酸作为探针进行杂交筛选，最后所得到的重复单元类型大部分与探针所含的SSR序列相同，表明了不同的重复单元出现的频率也受外源因素的影响。但可以肯定的是，二核苷酸重复出现的频率普遍都高于三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸重复。
　　3.2SAM法分离SSR序列及多态性SSR标记效率
　　本研究参照Hayden和Sharp的SAM法分离SSR序列，总共分离克隆了50个DNA片段，最后得到20个含有SSR序列并相互不重复的片段，设计了23对引物，其中22对表现多态性。从测序算起，实际阳性克隆效率为42%，产生多态性SSR标记的效率约为44%。李明芳等同样用SAM法在荔枝SSR引物开发中，所获得的阳性克隆达93%。两个研究所得的实际阳性克隆效率差异较大，可能有2个原因：一是两种材料之间的差异性。虽然微卫星重复序列广泛分布在基因组之间，但其含量、类型及重复的长度在不同的材料中存在差异，即使在同一物种的群体中也会存在差异；另一个是选择的5′锚定兼并引物不相同。相比之下，用SAM法得到的阳性克隆效率均比用经典构建和筛选小插入片段基因组文库的方法，或者是STMS法所得到的高很多。如Tokuko等用经典的方法最后只在6 000个克隆中得到3个含SSR序列的阳性克隆，占0.05%。Rajora O.P等用STMS法在4 028个克隆中最后得到阳性克隆71个，效率为1.8%。同样，也有报道用STMS法对不同的芭蕉属植物中进行SSR标记的开发，如Buhariwalla HK等和Kaemmer D等他们都用含微卫星序列的探针进行杂交、筛选，最后获得阳性克隆的效率分别为4%和2.8%，产生多态性SSR标记的效率分别为43.6%和9.4%。
　　
　　4结论
　　
　　由以上所获得的结果表明，本研究中所采用的开发SSR标记的方法不仅简便、效率高且成本低。此外，而本研究利用SAM法所获得的引物对与前两者都不同，主要是在本研究中发现，5′锚定引物的简并性，导致该引物与设计的特异引物配对后，部分引物对在进行检测时，扩增得到的条带不清晰且稳定性较低。因此，为了增加扩增的稳定性，本研究也首次在原来的方法中加以改进，就是在设计每条特异引物的序列中，再分别设计合适的特异引物来取代5′锚定引物，使每对引物都成为特异的标记，这些特异的标记在检测中表现出的特异性和稳定性均比与5′锚定引物配对的高，而且条带的清晰度也有所增强。
　　
　　5参考文献
　　[1] 杜道林，苏杰，周鹏，等.香蕉33个品种的RAPD研究[J].植物学，2001，43（10）：1036-1042.
　　[2] 易干军，余晓英，霍合强，等.粉蕉、大蕉和龙牙蕉的AFLP分类研究[J].园艺学报，2002，29（5）：413-417.
　　[3] 杨进.SSR分子标记技术在植物遗传多样性研究上的应用[J].中国农学通报，2006，22（7）：90-94.
　　[4] TOKUKO UJINO，TAKAYUKI KAWAHARA，YOSHIHIKO TSUMURA，et al.Development and polymorphism of simple sequence repeat DNA markers for Shorea curtisii and other Dipterocarpaceae species[J].Heredity，1998，81（4）：422-428.
　　[5] HUANG H B，SONG Y Q，HSEI M，et al.Development and characterization of genetic mapping resources for the Turkey（Meieagris gallopavo）[J].The Journal of Heredity，1999，90（1）：240-242.
　　[6] RAJORA O P，RAHMAN M H DAYANANDANS.Isolation，characterization，inheritance and linkage of microsatellite DNA markers in white spruce（Picea glauca） and their usefulness in other spruce species[J].Mol Gen Genet，2001，264（6）：871-882.
　　[7] BUHARIWALLA H K，L.JARRET R，JAYASHREE B，et al.Isolation and characterization of microsatellite markers from Musa balbisiana[J].Molecular Ecology Notes，2005（5）：327-330.
　　[8] KANCMMER D，FISCHER D，JARRET R.L，et al.Molecular breeding in the genus Musa：a strong case for STMS marker technology[J].Euphytica，1997，96（1）：49-63.
　　[9] HAYDEN M J，SHARPPJP.J.Targeted development of informative microsatellite（SSR）markers[J].Nucleic Acids Research，2001，29（8）：44.
　　[10] PATERSON AH，BRUBAKER C L，WENDEL J.F.A rappid method for extraction of cotton（Gossypium Spp）genomic DNA suitable for RFLP or PCR analysis[J].Plant Mol Bio Rep，1993，11（2）：122-127.
　　[11] RIVERA R，EDWARDS K J，BARLER J.H.A，et al.Isolation and characterization of polymorphic microsatellites in cocos nucifera L[J].Genome，1999，42（4）：668-675.
　　[12] VIRUEL M.A，HORMAZA J.I.Development，characterization and variability analysis of microsatellites in lychee（Litchi chinensis Sonn.，Sapindaceae）[J].Theor Appl Genet，2004，108（5）：896-902.
　　[13] YAISH W F，PEREZ DE LAVEGAM.Isolation of（GA）nMicrosatellite Sequences and Description of a Predicted MADS-box Sequence Isolated from Common Bean（Phaseolus vulgaris L.）[J].Genetics and Molecular Biology，2003，26（3）：337~342.
　　[14] HUTOKSHI K，CROUCH H.J，ROBERT L，et al.Segregation at Microsatellite loci in Haploid and Diploid Gametes of Musa[J].Crop Sci，1998，38（1）：211-277.
　　[15] 李明芳，郑学勤.荔枝SSR标记的研究[J].遗传，2004，26（6）：911-916.
　　[16] 张军，武耀廷，郭旺珍，等.棉花微卫星标记的PAGE/银染快速检测[J].棉花学报，2000，12（5）：267-269.
　　
　　注：“本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文。”
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