蜂胶总黄酮含量 [东北铁线莲中木犀草素及总黄酮含量的测定]

　　摘要：选用木犀草素和芦丁为对照品，采用高效液相色谱法和分光光度法分别测定了东北铁线莲中木犀草素及总黄酮的含量，色谱柱为Ｄｉａｍｏｎｓｉｌ Ｃ１８（２５０ ｍｍ×４．６ ｍｍ，５ μｍ），以甲醇－０．４％磷酸溶液（３０∶７０，V/V） 为流动相，流速为１．０ｍＬ／ｍｉｎ，梯度洗脱，木犀草素的检测波长为３５０ ｎｍ，进样量为２０ μＬ，柱温４０ ℃，总黄酮的检测波长为５１０ ｎｍ。结果表明，木犀草素进样浓度在０．５~２０．０ μｇ／ｍＬ范围内线性关系良好（r＝０．９９９ ４），平均回收率为９９．２１％，ＲＳD值为２．７２％；芦丁进样浓度在８．０４～４８．２４ μｇ／ｍＬ范围内线性关系良好（r＝０．９９９ ９），平均回收率为９９．３４％，ＲＳＤ值为１．９７％。采用高效液相色谱法和分光光度法测定东北铁线莲中木犀草素及总黄酮的含量，方法简便、准确，可以用于东北铁线莲的质量控制。
　　关键词：东北铁线莲；木犀草素；芦丁；高效液相色谱法；分光光度法
　　中图分类号：ＴＱ２４４．２文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０11）14－2958-04
　　
　　Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｕｔｅｏｌｉｎ ａｎｄ Ｔｏｔａｌ Ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ ｉｎ Ｃｌｅｍａｔｉｓ ｍａｎdｓｈｕｒｉｃａ Ｒｕｐｒ．
　　
　　ＺＨＯＮＧ Ｆａｎｇ－ｌｉ，ＷＡＮＧ Ｘｉａｏ－ｌｉｎ，ＨＵＡＮＧ Ａｉ－ｚｈｅｎ
　　（Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ｊｉｌｉｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｊｉｌｉｎ １３２０２２， Ｊｉｌｉｎ，Ｃｈｉｎａ）
　　
　　Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ｌｕｔｅｏｌｉｎ ａｎｄ ｔｏｔａｌ ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ ｉｎ Ｃｌｅｍａｔｉｓ ｍａｎdｓｈｕｒｉｃａ Ｒｕｐｒ. ｗas ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｂｙ ＨＰＬＣ ａｎｄ ＵＶ ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｙ． Ｔｈｅ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｅｌｕｔｉｏｎ ｍｏｂｉｌｅ ｐｈａｓｅ ｓｙｓｔｅｍ ｗａｓ ＣＨ３ＯＨ－０．４％ Ｈ３ＰＯ４（３０∶７０，V/V） ｗｉｔｈ Ｄｉａｍｏｎｓｉｌ Ｃ１８（２５０ｍｍ×４．６ｍｍ， ５ μｍ） ｃｏｌｕｍｎ． Ｔｈｅ ２０ μＬ ｓａｍｐｌｅ ｗａｓ ｓｅｐａｒａｔｅｄ ａｔ ４０ ℃ at the ｒａｔｅ ｏｆ １．０ ｍＬ／ｍｉｎ and detected ａｔ ３５０ ｎｍ ａｎｄ ５１０ ｎｍ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅｒｅ ｗａｓ ｇｏｏｄ ｌｉｎｅａｒ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｂｅｔｗｅｅｎ ｉｎｔｅｇｒａｌ ｖａｌｕｅ ｏｆ ｐｅａｋ ａｒｅａ ａｎｄ ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ｌｕｔｅｏｌｉｎ ｉｎ ｔｈｅ ｒａｎｇｅ ｏｆ ０．５～２０．０ μｇ／ｍＬ（R＝０．９９９ ４）． Ｔｈｅ ａｖｅｒａｇｅ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ｌｕｔｅｏｌｉｎ ｗａｓ ９９．２１％ ｗｉｔｈ ＲＳＤ ｏｆ ２．７２％． Ｔｈｅｒｅ ｗａｓ also ｇｏｏｄ ｌｉｎｅａｒ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｂｅｔｗｅｅｎ ｉｎｔｅｇｒａｌ ｖａｌｕｅ ｏｆ ｐｅａｋ ａｒｅａ ａｎｄ ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ｌｕｔｉｎ ｉｎ ｔｈｅ ｒａｎｇｅ ｏｆ ８．０４～４８．２４ μｇ／ｍＬ（R＝０．９９９ ９）． Ｔｈｅ ａｖｅｒａｇｅ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ｌｕｔｉｎ ｗａｓ ９９．３４％ ｗｉｔｈ ＲＳＤ ｏｆ １．９７％． Ｉｎ ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ， ｔｈｅ ｔｗｏ ｍｅｔｈｏｄｓ were ｃｏｎｖｅｎｉｅｎｔ ａｎｄ ａｃｃｕｒａｔｅ thus could ｂｅ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｑｕａｌｉｔｙ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ Ｃ. ｍａｎdｓｈｕｒｉｃａ．
　　Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｃｌｅｍａｔｉｓ ｍａｎdｓｈｕｒｉｃａ Ｒｕｐｒ.； ｌｕｔｅｏｌｉｎ； ｔｏｔａｌ ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ； ＨＰＬＣ； ＵＶ ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｙ
　　
　　东北铁线莲（Ｃｌｅｍａｔｉｓ ｍａｎdｓｈｕｒｉｃａ Ｒｕｐｒ．）为毛茛科铁线莲属植物，主要分布于东北及内蒙北部地区，一般根部入药，嫩叶、地上茎可食用，东北铁线莲中含有丰富的生物活性物质，主要用于治疗风湿痹痛、关节不利等症状，现代药理研究表明具有多种药理作用，如解痉、镇痛抗炎、抗肿瘤、利胆和降血压等功效［１－３］。
　　总黄酮作为一类重要的天然有机化合物，因其具有众多药理作用如抗癌抗肿瘤、抗心脑血管疾病、抗炎镇痛、抑菌抗病毒、抗氧化抗衰老而越来越受到人们的关注［４］，木犀草素是一种重要黄酮化合物，在自然界分布广泛，具有良好抗氧化性［５］和抗菌性［６］，具有降低血脂和胆固醇，降压及免疫双向调节药理作用［７］，可作为食品天然抗氧化剂和防腐剂开发，具有广阔开发与应用前景。
　　目前关于东北铁线莲中总黄酮和木犀草素的含量测定尚未见报道，该文建立了东北铁线莲中总黄酮和木犀草素的含量测定方法，为东北铁线莲的综合利用提供科学的理论依据。
　　１材料与方法
　　１．１材料与试剂
　　东北铁线莲购自安徽省亳州市华申药业有限公司；木犀草素和芦丁对照品均购自中国药品生物制品检定所（木犀草素批号１１１５２０－２００５０４，供含量测定用；芦丁批号１０００８０－２００７０７，供含量测定用）；甲醇（色谱纯，天津大茂化学试剂公司）；水为二次蒸馏水；其余所用试剂均为分析纯。
　　１．２仪器
　　ＬＣ－１０ＡＤ型高效液相色谱仪配备（日本岛津公司），ＳＰＤ－１０Ａｖｐ紫外－可见检测器；７５２Ｎ紫外可见分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）；超声波药品处理机（济宁金百特电子有限责任公司ＪＢＴ/Ｃ－ＹＣＬ）；ＢＰ２１１Ｄ 型电子天平（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ公司）；ＲＴ－０８手提式高速中药粉碎机（大德乐机械有限公司）。
　　２方法与结果
　　２．１木犀草素含量测定
　　２．１．１色谱条件参照文献［８－１１］分别对甲醇－水、甲醇－０．２％（Ｖ／Ｖ）磷酸溶液和甲醇－０．４％（Ｖ／Ｖ）磷酸溶液三种流动相进行了选择，结果表明甲醇－０．４％（Ｖ／Ｖ）磷酸溶液为流动相时，分离度为３．１５８，理论塔板数为１６ ３９３，保留时间约为３０ ｍｉｎ左右，以梯度洗脱方式对木犀草素进行洗脱，洗脱程序为０ ｍｉｎ到１５ ｍｉｎ，４０％Ａ到６０％Ａ；１５ ｍｉｎ到２０ ｍｉｎ，６０％Ａ到７０％ Ａ；２０ ｍｉｎ到３０ ｍｉｎ，７０％Ａ到８０％Ａ；３０ ｍｉｎ到３５ ｍｉｎ，８０％Ａ到９５％Ａ；３５ ｍｉｎ 到４５ ｍｉｎ，９５％Ａ；４５ ｍｉｎ 到５５ ｍｉｎ，９５％Ａ到３０％Ａ；５５ ｍｉｎ 到６０ ｍｉｎ，３０％Ａ～停泵，其中Ａ为甲醇，Ｂ为０．４％（Ｖ／Ｖ）磷酸溶液。根据以上试验结果确定色谱条件：色谱柱［１２］为Ｄｉａｍｏｎｓｉｌ Ｃ１８（２５０ ｍｍ×４．６ ｍｍ， ５ μｍ）；流动相为甲醇－０．４％磷酸溶液（Ｖ／Ｖ＝３０∶７０）；流速： １．０ ｍＬ／ｍｉｎ，梯度洗脱；柱温：４０℃，进样量２０ μＬ，检测波长为 ３５０ ｎｍ。分别取对照品溶液，供试品溶液各２０ μＬ，注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定，记录色谱图，结果见图１、２。
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　　２．１．２对照品溶液的制备取木犀草素对照品适量，精密称定，加甲醇配制为８０ μｇ／ｍＬ对照溶液。
　　２．１．３供试品溶液的制备称取２．０ ｇ东北铁线莲药粉，加入２０ ｍＬ甲醇，摇匀。超声提取４５ ｍｉｎ，静置，冷却至室温，过滤，用５ ｍＬ甲醇清洗滤渣一次，过滤，合并滤液，转移至２５ ｍＬ容量瓶中，并用甲醇稀释至刻度，摇匀，用０．４５ μｍ微孔滤膜过滤，作为供试品溶液。
　　２．１．４方法线性范围考察精密吸取木犀草素对照品适量，分别配制成浓度为０．５，１．０，２．０，４．０，８．０、１０．０和２０．０ μｇ／ｍＬ的梯度溶液，分别吸取各梯度溶液２０ μＬ，注入液相色谱仪，记录峰面积，以木犀草素对照品进样浓度Ｃ（μｇ／ｍＬ）为横坐标，峰面积积分值Ａ为纵坐标，绘制标准曲线。得回归方程Ａ＝６６６．８７０Ｃ＋４５．７８７，ｒ＝０．９９９ ４，结果表明木犀草素进样浓度在０．５０～２０．００ μｇ／ｍＬ范围内呈良好的线性关系。
　　２．１．５精密度实验精密吸取线性关系项下浓度为１０．０ μｇ/ｍＬ的对照品溶液，连续进样５次，测定木犀草素吸收峰面积积分值，ＲＳＤ值为１．７０％，表明本实验精密度良好。实验结果见表１。
　　２．１．９样品测定取５份东北铁线莲药粉，按“２．１．３”项下的的制备方法制备供试品溶液，按２．１．１色谱条件测定，测得木犀草素的含量分别为２９．１２５、２９．０２０、３０．７８８、３０．３４８、３０．５７８ μｇ／ｇ，平均含量为２９．９７２ μｇ／ｇ，由此可知东北铁线莲中木犀草素的含量较低。
　　２．２总黄酮含量测定
　　２．２．１对照品溶液的制备精密称取芦丁对照品０．２０１ ｇ，加６０％（Ｖ／Ｖ）乙醇稀释到１００ ｍＬ，摇匀，即得浓度为２．０１ ｍｇ／ｍＬ的对照品溶液。
　　２．２．２供试品溶液的制备称取２．０ ｇ东北铁线莲药粉，精密称定，置５０ ｍＬ容量瓶中，加入６０％（Ｖ／Ｖ）乙醇２０ ｍＬ，摇匀，超声提取３０ ｍｉｎ，静置，冷却至室温，过滤，滤渣重复上述超声提取过程１次，滤过，滤渣用５ ｍＬ ６０％（Ｖ／Ｖ）乙醇清洗１次，过滤，合并２次所得滤液，加６０％（Ｖ／Ｖ）乙醇定容至５０ ｍＬ，摇匀，得供试品溶液。
　　２．２．３检测波长的选择吸取芦丁对照品溶液和供试品溶液各２ ｍＬ于２５ ｍＬ容量瓶中，加６０％（Ｖ／Ｖ）乙醇４ ｍＬ，摇匀，静置６ ｍｉｎ，加５％（ｍ／Ｖ）ＮａＮＯ２ ０．４ ｍＬ，摇匀，静置６ ｍｉｎ，加１０％（ｍ／Ｖ）Ａｌ（ＮＯ３）３ ０．４ ｍＬ，摇匀，静置６ ｍｉｎ，再加入４％（ｍ／Ｖ）ＮａＯＨ ４ ｍＬ，摇匀，用６０％（Ｖ／Ｖ）乙醇定容到刻度，放置１５ ｍｉｎ，同时作空白对照，在４００～６００ ｎｍ范围内进行波长扫描［１３］，结果对照品溶液和供试品溶液均在５１０ ｎｍ有最大吸收，由此确定检测波长为５１０ ｎｍ。
　　２．２．４方法线性范围考察分别精密移取０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６ ｍＬ芦丁对照品溶液于２５ ｍＬ容量瓶中，加６０％（Ｖ／Ｖ）乙醇４ ｍＬ，摇匀，静置６ ｍｉｎ，加５％（ｍ／Ｖ）ＮａＮＯ２ ０．４ ｍＬ，摇匀，静置６ ｍｉｎ，加１０％（ｍ／Ｖ）Ａｌ（ＮＯ３）３ ０．４ ｍＬ，摇匀，静置６ ｍｉｎ，加４％（ｍ／Ｖ）ＮａＯＨ ４ ｍＬ，摇匀，用６０％（Ｖ／Ｖ）乙醇定容到刻度，放置１５ ｍｉｎ，同时作空白对照，分别在５１０ ｎｍ波长处测定吸光度，以对照品浓度Ｃ（ｍｇ／ｍＬ）为横坐标，吸光度Ａ为纵坐标，绘制标准曲线。求得回归方程Ａ＝１１．７４８Ｃ＋０．００３，ｒ＝０．９９９ ９，结果表明芦丁进样浓度在０．００８ ０４～０．０４８ ２４ ｍｇ／ｍＬ范围内呈良好的线性关系。
　　２．２．５精密度实验吸取标准曲线项下浓度为０．０１６ ０８ ｍｇ／ｍＬ的芦丁对照品溶液２ ｍＬ，按“２．２．４”项下方法连续测定５次吸光度，记录数据，结果ＲＳＤ值为０．９５％，精密度良好。
　　２．２．６稳定性实验称取２．０ ｇ东北铁线莲药粉，精密称定，置５０ ｍＬ容量瓶中，按“２．２．２”项下方法配制供试品溶液，按“２．２．４”项下方法，分别于配制后０、３０、６０、９０和１２０ ｍｉｎ测定吸光度，ＲＳＤ值计算结果为１．６２％，表明供试品溶液在实验条件下１２０ ｍｉｎ内基本稳定，可满足测定要求。
　　２．２．７重复性实验取同一批东北铁线莲药粉，按“２．２．２”项下的制备方法制备５份供试品溶液，依法测定吸光度，结果ＲＳＤ值为１．３９％，重复性较好。
　　２．２．８加样回收率实验称取已知含量（４．４２５ ｍｇ/ｇ）的东北铁线莲药粉约２ ｇ，共５份，精密称定，分别精密加入芦丁对照品溶液２．０ ｍＬ，按“２．２．２”项下的制备方法制备５份供试品溶液，按“２．２．４”项下方法测定吸光度，结果表明平均回收率为９９．３４％，ＲＳＤ值为１．９７％。实验结果见表５。
　　２．２．９样品测定取５份东北铁线莲药粉，按“２．２．２”项下的的制备方法制备５份供试品溶液，按“２．２．４”项下方法测定吸光度，结果测得总黄酮的含量分别为４．４３７、４．４２４、４．４０６、４．３９７、４．４３７ ｍｇ/ｇ。
　　３讨论
　　３．１高效液相色谱法检测波长的选择
　　文献报道，采用高效液相色谱法测定木犀草素含量时，一般分别在３５０ ｎｍ［９，１０］，２５４ ｎｍ［１１］的检测波长条件下进行了研究，本实验采用紫外分光光度计对木犀草素对照品溶液进行全波长扫描，以甲醇作为空白试剂，结果木犀草素的最大吸收波长为３５０ ｎｍ，根据实验结果和参考文献确定３５０ ｎｍ为本实验的检测波长。
　　３．２高效液相色谱法分离柱的选择
　　根据参考文献［１２］，选择的色谱柱为Ｄｉａｍｏｎｓｉｌ Ｃ１８（２５０ ｍｍ× ４．６ ｍｍ，５ μｍ，）。
　　３．３高效液相色谱法供试品溶液制备方法的选择
　　根据所查阅的文献［８］，本实验以甲醇为溶剂，分别对热回流法、索氏提取以及超声提取３种提取方式进行选择。结果热回流法木犀草素峰面积、拖尾因子分别为７２０．９０６、２．０７１，索氏提取法木犀草素峰面积、拖尾因子分别为６３７．４００、２．１７９，超声提取法木犀草素峰面积、拖尾因子分别为１ ５５２．３００、１．５７２，根据木犀草素的峰面积、拖尾因子确定超声提取为较佳的提取方法，并在此基础上进行了超声次数、超声时间进行了探索。
　　３．３．１超声次数的选择本实验考察了超声次数对提取效果的影响，精密称取２．０ ｇ东北铁线莲粉末，提取２次，每次加入２０ ｍＬ甲醇，每次超声提取４５ ｍｉｎ，过滤，分别收集１、２次提取液，将各次提取液分别置于２５ ｍＬ容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀。用微孔滤膜（０．４５ μｍ）过滤，取滤液作为供试品溶液，按正文色谱条件进行含量测定，第１次提取液测得的木犀草素峰面积１ ６９８．０５６，第２次提取液在相应的保留时间处没有吸收峰，由此可见第２次的提取量已经很小，故将提取次数确定为１次。
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　　本实验建立的总黄酮和木犀草素含量测定方法操作简便，方法精密度高，重复性及线性关系良好，回收率较好，对于评价东北铁线莲的内在质量具有一定的参考意义。
　　
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　　注：本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文
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