灰霉病菌抗药性发生概况及机理研究进展|害虫抗药性形成机理

　　摘要综述国内外灰霉病菌抗药性发生概况,总结了灰霉病菌抗药性机理方面的研究报导,并提出防止灰霉病抗药性发生的相关建议。 　　关键词灰霉病菌;抗药性;机理;研究进展
　　中图分类号 S482.2 文献标识码A文章编号 1007-5739(2009)11-0117-02
　　
　　近几年灰霉病已成为影响保护地蔬菜产量和质量的重要因素,灰霉病对杀菌剂极易产生抗药性,也成为生产上亟待解决的一大难题。掌握灰霉病菌的抗性发生现状,了解其抗性机理,对防止抗性的发生,延长药剂的使用寿命,具有重要的现实意义。
　　
　　1灰霉病菌抗药性发生概况
　　
　　灰霉病菌具有繁殖快、遗传变异大和适合度高等特点,连续使用同一药剂易产生抗药性。目前,灰葡萄孢霉己对苯并咪唑类、二甲酰亚胺类、N-苯氨基甲酸酯类和苯胺基嘧啶类杀菌剂产生了不同程度的抗性。
　　自从1971年,Bollen和Scholten在荷兰温室中的仙客来上发现灰霉菌对苯来特的抗性菌株以来,美国、英国、法国、以色列、意大利等地的葡萄、草莓、番茄上的灰霉病菌也都相继发生了抗药性,使得苯并咪唑类杀菌剂的防效迅速下降[1,2]。我国使用该类杀菌剂己有多年历史,1987年,叶钟音等对从梅果上分离到的灰霉病菌菌株进行紫外光诱导获得对多菌灵的抗性菌株,其抗性水平很高[3]。同年周明国等在南京市郊发现个别灰霉病菌菌株已对多菌灵产生抗药性[4]。刘慧平等对山西各地188个灰葡萄孢霉菌株抗性监测发现菌株对多菌灵产生严重抗性[5]。多菌灵抗性菌株其产孢能力并不比敏感菌株低,继代培养抗性程度也不下降[6]。
　　二甲酰亚胺类杀菌剂属于多作用位点的杀菌剂,病菌对它的抗性增长缓慢。Leroux(1977)首次得到了抗二甲酰亚胺类杀菌剂的灰霉病菌的突变体[7]。20世纪80年代,瑞典、新西兰、意大利和加拿大发现抗性菌株[8,9]。2003年对山西灰霉病菌抗性监测结果表明,灰霉病菌对腐霉利表现出低水平抗性[10]。江苏蔬菜灰葡萄孢霉对腐霉利的田间抗性水平也大都属低抗范围[11]。研究认为这类杀菌剂可能是特殊位点抑制剂,目标真菌的抗性遗传是由单基因决定的质量遗传,一次突变即可使抗性水平提高,且有稳定的遗传性[12-14]。其中腐霉利、扑海因之间存在正交互抗性,与苯并咪唑类和传统的保护性杀菌剂之间无交互抗性。
　　Leroux和Gredt于1979年首先发现N-苯氨基甲酸酯类化合物燕麦灵(barbon)、氯苯胺灵(chlorprophan)和氯草灵(chlorbufam)防治灰霉病和青霉病与苯并咪唑类杀菌剂表现负交互抗性。1984年日本住友公司开发了杀菌剂乙霉威(Kato,1984),它与苯并咪唑杀菌剂存在负交互抗性,但使用不久后,即在意大利[15],以色列[13]、英国[9]等地,陆续发现了既抗多菌灵又抗乙霉威的灰霉病菌菌株。
　　1996年在法国和瑞士检测到嘧霉胺的抗性菌株,此时距其使用仅2年时间。1994年,在用嘧菌环胺处理了4次的葡萄园田块上采集了20个灰葡萄孢霉菌株,测定结果表明病菌对嘧菌环胺的敏感性都已经下降了。在相邻田块中,灰葡萄孢霉的抗性频率为10%~15%。由于2个田块相隔很近,有可能是抗性菌株通过风或雨水扩散的结果[16]。1993~1995年在瑞士,从不同程度上用过苯胺基嘧啶类杀菌剂的葡萄园中分离得到的303个灰葡萄孢霉菌株,离体检测结果表明,其中有3株已表现出抗药性[16]。中国于20世纪90年代末开始推广使用苯胺基嘧啶类杀菌剂,目前已有抗药性报道。纪明山等发现辽宁省保护地番茄灰霉病菌已对嘧霉胺产生抗药性,处于中抗水平,平均抗性频率达22.9%[17]。
　　
　　2灰霉菌抗性机理
　　
　　自1994年对法国葡萄园实施抗药性监测以来,灰葡萄孢霉的田间种群中发现3种苯胺基嘧啶类抗性表现型(AniRl、AniR2和AniR3)。遗传学分析显示,对于每种表现型,其抗性分别是由主效基因Anil、Ani2或Ani3决定的。AniRl菌株在离体条件下对任意一种苯胺基嘧啶类杀菌剂都有中度至高度抗性;AniR2和AniR3菌株对苯胺基嘧啶类的抗性主要表现在芽管的伸长阶段[18,19]。各种抗性表现型中,根据杀菌剂对萌发管伸长和菌丝生长的离体作用,共有3种主要的情况:各阶段都表达抗性,即抗微管毒剂(Ben R1、BenR2),咪唑啉酮类(ImiR1)、苯胺基嘧啶类(AniR1)、羟基苯胺类(HydR3);主要对萌发管延长表达抗性,即多药剂抗性表现型(AniR2、AniR3);对菌丝生长表达抗性,即羟基苯胺类(HydR2)。
　　田间发现了各种表现型,但只有显示以上这两阶段的离体抗性。田间灰葡萄孢菌菌株主要存在3种抗性机理,即毒剂渗透性减弱、脱毒作用增强和毒性代谢产物转换作用的减弱、靶标位点敏感性降低。
　　
　　2.1毒剂渗透性减弱
　　几种杀菌剂以活性形式自灰葡萄孢菌菌丝释出,并且在法国葡萄园检测到多药耐药(MDR)基因表现型(AniR2、AniR3),这说明腺苷三磷酸结合暗盒(ABC)运输器参与杀菌剂抗性。该现象很可能基于ABC运输器的产生过剩,其也发生在灰葡萄孢菌的实验室突变种、指状青霉[Pencilli-um digitatum(Pers)Sass]的天然菌株以及人类病原菌白假丝酵母[Candida albicans(Robin)Berkhour]对甾醇甲基抑制剂(DMIs)产生抗性的过程中。ABC运输器活性的特异性抑制剂可与抗性产生机理激活的杀菌剂产生协同作用。ABC运输器也参与植物防卫物质和致病因子的分泌,因此其抑制剂也可降低真菌致病性。
　　
　　2.2脱毒作用增强和毒性代谢产物转换作用的减弱
　　第2个农药抗性机理是由于抗性菌株中包含的酶,如细胞色素P450单氧化酶(CYP450)、水解酶和谷氨酸S-转移酶数量增加,造成脱毒作用。在一些案例中,减弱的生物转化能够降低药的激活作用。CYP450是内源性和外源性化合物代谢过程中重要的代谢系统。由于许多CYP450的底物专一性较低,其中和的抗性在代谢引起的杀菌剂抗性中最为常见,第1个涉及CYP450的抗性真菌案例是水稻稻瘟病菌(P.oryzae)对硫代磷酸酯类杀菌剂的抗性。灰葡萄孢菌的数据表明,HydR1和HydR2表现型对环酰菌胺的抗性很可能与CYP450引起的羟基苯胺脱毒作用(六元环羟基化作用)的增强有关。灰葡萄孢菌的基因组序列和微生物分析可以对杀葡萄孢菌剂抗性涉及的CYP450异型进行鉴别。水解酶是涉及许多种杀虫剂抗性的一大类酶,尤其是对有机磷类。由于水解作用增强,导致苹果黑星病菌[Venturia inaequalis(Cooke)Winter]对嘧菌酯产生抗性,这是由于对Strobilurin类杀菌剂的天然抗性所致。一些灰葡萄孢菌田间菌株对卵纲菌杀菌剂霜脲氰敏感,并能很快代谢,很可能就是由于水解酶的作用。谷胱甘肽硫转移酶(GSTs)是一类多功能酶,可催化合成或天然亲电化合物的还原性谷氨酸亲核加成反应。通常该反应形成共轭,是重要的农药脱毒机制。最近从灰葡萄孢菌菌株克隆和分离的GST显示其不具有对化学压力耐受性的作用。破坏突变种也不降低致病力,说明GST不涉及植物防卫系统的脱毒作用。谷氨酸也参与导致硫醇反应物(如多位点杀菌剂)脱毒的非酶反应,增进灰葡萄孢菌的谷氨酸生物合成,造成对克菌丹、百菌清的抗性。另外,谷氨酸体系也是许多生物的抗氧化防御系统的重要组成部分。根据Ellner的研究,一些二甲酰亚胺类抗性灰葡萄孢菌菌株的谷氨酸合成酶浓度上升可能就是该类药剂产生抗性的机理,也可解释二甲酰亚胺类和多位点杀菌剂抑菌灵产生交互抗性的原因。
　　
　　2.3靶标位点敏感性降低
　　对杀菌剂抗性菌株的产生,可以用多种真菌,包括灰葡萄孢菌对苯并咪唑类的抗性菌株说明其机理。对多数田间菌株,苯并咪唑类抗性的产生与β-微管蛋白基因的氨基酸密码子198位或200位上发生等位突变有关;密码子198位上的突变也使菌株对苯基甲酸酯类的敏感性升高。对二甲酰亚胺类及其相关杀菌剂,灰葡萄孢菌所有的田间抗性菌株和实验室突变种的产生都与组胺激酶基因一个碱基对的突变有关。然而,该激酶是否就是二甲酰亚胺类的主要靶标位点还需论证。分别对苯胺基嘧啶类和环酰菌胺有抗性的AniR1和HydR3菌株的性质研究发现,抗性机理中包括各靶标位点敏感性下降。通过对编码齿孔醇14α-去甲基酶的灰葡萄孢菌CYP51基因的分析发现,HydR1菌株在密码子15位和105位上发生表达性突变,使得其对DMIs的敏感性降低。所有的灰葡萄孢菌田间菌株,包括HydR1,与其他菌类的DMIs抗性分离株一样,在密码子136位上有一个酪氨酸,而不是苯丙氨酸。
　　
　　3结论
　　
　　灰霉病是由灰霉病菌引起的世界性的重要病害,很久以来对农业生产造成严重危害。由于其对各类杀菌剂均有不同程度的抗药性发生,在田间对该病的抗性治理已成为亟待解决的问题。国外对灰霉菌抗药性生物学及抗性机理方面的诸多研究,为灰霉病菌的科学治理及其抗性风险预测提供了理论依据。我国杀菌剂抗性研究起步较晚,研究水平还处于初级阶段。应加强对灰霉病菌抗性机理方面的研究,使我国在这一领域尽早赶上国际先进水平。同时,对于能有效防治该病菌的药剂应尽量延缓菌株对其抗药性的产生,延长药剂使用寿命。加强抗性监测,合理用药,在不同抗性发展水平地区采取相应的综合防治措施是解决抗性问题的有效途径。
　　
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