【重组人胶原蛋白肽的表达及纯化工艺的优化】胶原蛋白肽的功效与作用

　　摘要：将重组大肠杆菌ｐＣ６－ＢＬ２１活化后，用ＩＰＴＧ诱导表达，探讨了大肠杆菌中重组胶原蛋白肽的最佳表达及纯化条件。结果表明，菌株在３７ ℃，接种量为２％，摇瓶培养３．０ ｈ后，加入终浓度为０．５ ｍｍｏｌ／Ｌ的ＩＰＴＧ，３０ ℃诱导５．０ ｈ，收获的蛋白产量最高，经Ｎｉ－ＮＴＡ柱亲和层析纯化，用梯度咪唑缓冲液洗脱蛋白，１５０ ｍｍｏｌ／Ｌ咪唑缓冲液洗脱蛋白为纯蛋白，Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ分析显示该表达产物与人ＣＯＬ６Ａ２单克隆抗体有特异结合能力。
　　关键词：重组人胶原蛋白肽；纯化；表达
　　中图分类号：Ｑ８１６文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０11）13－2768-04
　　
　　Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｈｕｍａｎ Ｃｏｌｌａｇｅｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ
　　
　　ＷＵ Ｍｉｎｇ，ＸＵ Ｚｈｅｎ－ｚｈｅｎ，ＷＡＮＧ Gａｎｇ，ＳＵＮ Ｙａｎｇ，ＣＨＥＮ Ｇｕａｎｇ
　　（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｊｉｌｉｎ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｃｈａｎｇｃｈｕｎ １３０１１８， Jilin，Ｃｈｉｎａ）
　　
　　Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｏ ｏｐｔｉｍｉｚｅ ｔｈｅ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｏｆ recombinant hｕｍａｎ cｏｌｌａｇｅｎ pｅｐｔｉｄｅ（ＣＰ６） ｉｎ Ｅ． ｃｏｌｉ ｐＣ６－ＢＬ２１， ｔｈｅ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ， ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｔｙ ａｎｄ ｔｉｍｅ ｆｏｒ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ａｓ ｗｅｌｌ ａｓ ｉｎｄｕｃｅｒ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｆｏｒ ＣＰ６ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｅ． ｃｏｌｉ ｗａｓ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ． Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｗｅｒｅ ａｓ ｆｏｌｌｏｗｓ， ａｆｔｅｒ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｎｇ ａｔ ａｎ ａｍｏｕｎｔ ｏｆ ２％， ｔｈｅ ｂａｃｔｅｒｉａ ｗere ｆｅｒｍｅｎｔｅｄ ｆｏｒ ３.0 ｈ ａｔ ３７ ℃； ｔｈｅｎ ０．５ ｍｍｏｌ／Ｌ ＩＰＴＧ ｗａｓ ａｄｄｅｄ ａｓ ｉｎｄｕｃｅｒ； ａｎｄ ｔｈｅ ｐｅｐｔｉｄｅ ｗａｓ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｕｎｄｅｒ ３０ ℃ ｆｏｒ ５．０ ｈ． Ａｆｔｅｒ ｆｅｒｍｅｎｔｅｄ ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ， ｔｈｅ ｌｙｓａｔｅ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａ ｗａｓ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｂｙ ｎｉｃｋｅｌ ｉｏｎ ａｆｆｉｎｉｔｙ； ａｎｄ ｐｕｒｉｔｙ ｏｆ ｔａｒｇｅｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗａｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｂｙ ＳＤＳ－ＰＡＧＥ． Ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｐｕｒｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｉｆ ｅｌｕｔｅｄ ｂｙ １５０ ｍｍｏｌ／Ｌ ｉｍｉｄａｚｏｌｅ ｂｕｆｆｅｒ ａｆｔｅｒ ｂｅｉｎｇ ｐｕｒｉｆｉｅｄ， aｎｄ ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｕｌｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ ｂｉｎｄ ｗｉｔｈ ｈｕｍａｎ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ＣＯＬ６Ａ２．
　　Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： rｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ hｕｍａｎ cｏｌｌａｇｅｎ pｅｐｔｉｄｅ； ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ； ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ
　　
　　胶原蛋白是一类广泛分布于动物结缔组织的蛋白质［１］，对维护机体的正常生理功能和损伤修复有重要作用。目前胶原蛋白的生产主要是用酸、碱水解法从动物结缔组织提取，提取过程中会或多或少地丧失胶原蛋白的生物活性，应用于人体时还可能会产生排异反应，且存在着极大的病毒隐患［２，３］。鉴于胶原蛋白有广阔的应用前景，特别是医用材料、保健品领域迫切需要大量优质的胶原蛋白，寻找新的安全可靠的手段制备胶原蛋白十分重要，利用基因工程手段重组表达人胶原蛋白成为研究热点［４－６］。本实验以ＬＢ培养基为基础，采用单因素实验对重组人胶原蛋白在大肠杆菌中诱导表达的一系列条件，如接种量、诱导时机、诱导物浓度、诱导温度和表达时间等进行了优化［７］，并对所得的胶原蛋白进行了纯化和鉴定，为进一步研究发酵工艺提供了实验基础。
　　１材料与方法
　　１．１材料和试剂
　　实验菌种为重组大肠杆菌ｐＣ６－ＢＬ２１（ＤＥ３），由吉林农业大学生物物理实验室构建并保存。质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒、ＩＰＴＧ（异丙基硫代半乳糖苷）、蛋白胨（ＯＸＯＩＤ）、酵母提取物（Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ，ＹＥ）均购自北京鼎国生物工程有限公司；Ｎｉ－ＮＴＡ Ｈｉｓ・Ｂｉｎｄ树脂和Ｎｉ－ＮＴＡ缓冲液试剂盒均购自ＭＥＲＣＫ公司，其他试剂和药品均为国产分析纯。
　　１．２表达条件的优化
　　挑取一环－８０ ℃、２５％甘油保存的工程菌，接种于ＬＢ固体培养基中，３７ ℃培养２４ ｈ，然后挑单菌落于１００ ｍＬ ＬＢ液体培养基中，３７ ℃，２００ ｒ／ｍｉｎ振荡培养过夜，以活化菌种。活化后按不同接种量、诱导时机、诱导物ＩＰＴＧ浓度、诱导温度和表达时间设置单因素实验，诱导胶原蛋白的表达，单因素实验每个处理设置３个重复。①接种量：设置１％、２％、３％、４％、５％ ５个接种量水平，将活化的菌种接种到含有５０ ｍＬ ＬＢ培养基的２５０ ｍＬ的三角烧瓶中，３７ ℃、２００ ｒ／ｍｉｎ振荡培养４．０ ｈ至ＯＤ６００为０．７时，加入终浓度为１ ｍｍｏｌ／Ｌ的ＩＰＴＧ诱导，３７ ℃发酵培养４．０ ｈ；②诱导时机：将过夜活化的种子液按２％的接种量接种于５０ ｍＬ ＬＢ培养基中，３７ ℃，２００ ｒ／ｍｉｎ分别培养１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０ ｈ后加入终浓度为１ ｍｍｏｌ／Ｌ的ＩＰＴＧ进行诱导，３７ ℃发酵培养４．０ ｈ；③ＩＰＴＧ浓度：活化的菌种接种后在３７ ℃培养２．５ ｈ后加入ＩＰＴＧ至终浓度分别为０．１、０．３、０．５、０．７、１．０ ｍｍｏｌ／Ｌ，分别诱导培养５．０ ｈ；④诱导温度：按最佳接种量和最佳诱导物浓度，在不同的诱导温度下（２８、３０、３３、３７ ℃）诱导胶原蛋白的表达，确定最佳诱导温度；⑤表达时间：使用①～④所得的实验条件，分别在菌种诱导表达后２．０、３．０、４．０、５．０、６．０、７．０ ｈ取样，以确定最佳表达时间长度。
　　１．３重组蛋白含量的测定
　　①细胞密度测定：发酵液经稀释１～１０倍后，用可见分光光度计在６００ ｎｍ处测其光吸收值。②重组蛋白含量的测定：工程菌发酵结束后，取５０ ｍＬ经诱导的摇瓶培养发酵液，１０ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心１ ｍｉｎ，用０．５ ｍＬ ｐＨ值为７．４、５０ ｍｍｏｌ／Ｌ的Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ缓冲液洗涤沉淀，吸净上清液。用１～５ μＬ的蒸馏水重悬菌体，并立即加入等量的２×ＳＤＳ聚丙烯酰胺凝胶加样缓冲液，混匀后，沸水浴５ ｍｉｎ。吸取裂解后的样品液作聚丙烯酰胺凝胶电泳，考马斯亮蓝染色测定菌体总蛋白后，采用Ｂａｎｄｓｃａｎ软件扫描ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳图，分析出每条泳道重组蛋白占菌体总蛋白的百分含量并计算出重组蛋白含量。
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　　菌体经超声破碎后离心，上清经Ｎｉ－ＮＴＡ柱亲和层析，用１０倍体积２０ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（含０．３ ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ，ｐＨ ８．０）平衡柱体，然后分别用６０、１００、１２０、１５０ ｍｍｏｌ／Ｌ的咪唑缓冲液（ｐＨ ８．０）进行梯度洗脱，收集各个洗脱峰，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析收集的成分。
　　１．５重组蛋白的Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ鉴定
　　将纯化的重组蛋白进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ，转印至醋酸纤维素膜上，然后将膜在含５％的ＰＢＳ中室温封闭２.0 ｈ，洗膜后加入小鼠抗人ＣＯＬ６Ａ２的单克隆抗体（１∶２ ０００稀释）在４ ℃放置２.0 ｈ，洗膜后再加入羊抗鼠ＩｇＧ－ＨＲＰ（１∶２ ０００稀释）在４ ℃放置２.0 ｈ，充分漂洗后加入化学发光底物Ｓｕｐｅｒ Ｓｉｇｎａｌ检测试剂，暗室Ｘ光片暗匣曝光、显影。
　　２结果与分析
　　２．１接种量的优化
　　从图１可以看出，菌体的生物量随着接种量的增加而提高，而重组蛋白产量在接种量为２％时最高，继续增大接种量，其产量反而下降。这可能是由于接种量增加导致菌体生长过快过稠，造成营养基质缺乏或溶解氧不足而不利于发酵产蛋白［８］。考虑到在大规模发酵过程中，接种量过小会导致菌体增殖缓慢，而接种量过大对菌体生长和酶转化得率会产生一定抑制作用，确定２％为最佳接种量。
　　２．２ＩＰＴＧ诱导时机的优化
　　诱导时机对目的蛋白表达效果的影响比较大（图２），培养３．０ ｈ后，即对数生长中后期再添加诱导剂，蛋白的表达量最高。过早添加诱导剂会抑制菌体的增殖，导致生物量减少，在培养时间内获得的表达量也就低；过晚添加诱导剂，菌体已处于生长稳定期，培养基内营养成分减少，细胞代谢速度减缓，合成蛋白的能力降低，表达量也会减少。因此选择在对数生长中后期即培养３．０ ｈ后加入诱导剂。
　　２．３ＩＰＴＧ诱导浓度的优化
　　如图３所示，不同浓度的ＩＰＴＧ对外源蛋白的表达有一定的影响。低浓度条件下，随着ＩＰＴＧ的浓度增加，外源蛋白的表达量也增加，在ＩＰＴＧ浓度为０．５ ｍｍｏｌ／Ｌ时达到最大值，此后随着ＩＰＴＧ浓度的增加表达量反而下降。由于高浓度的ＩＰＴＧ会对菌体生长造成毒害作用，同时为了节约成本，选择０．５ ｍｍｏｌ／Ｌ为最适诱导浓度。
　　２．４诱导温度的优化
　　过低或过高的温度都会使菌体代谢缓慢，不利于外源基因的表达［９］。实验结果（图４）表明，随着温度升高，收获的菌体生物量先升后降，在３０ ℃时菌体生物量最高。而重组蛋白的表达随着温度的升高而加强，在３７ ℃时最高，因此选择３７ ℃为最佳诱导温度。
　　２．５表达时间的优化
　　如图５所示，诱导５．０ ｈ时蛋白表达量和生物量均达到最大值。继续诱导，生物量和表达量均下降。收集时间过早，蛋白的表达还不充分，收集时间过迟则可能导致细胞老化，自溶，发酵液中杂蛋白多，不利于纯化，综合考虑确定最佳诱导时间为５．０ ｈ。
　　２．６目的蛋白的分离纯化
　　大量诱导表达融合蛋白，经超声破碎、离心后，收集上清液，经Ｎｉ－ＮＴＡ柱亲和层析提纯重组蛋白，用梯度咪唑缓冲液洗脱蛋白，１５０ ｍｍｏｌ／Ｌ咪唑缓冲液洗脱蛋白为纯蛋白。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ检测见图６，重组蛋白相对分子质量约为４６ ｋｕ，与预期相符。
　　２．７重组蛋白的Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ鉴定
　　Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ（图７）分析显示，１号泳道空白对照无特异性反应条带，而２号泳道中纯化产物与小鼠抗人ＣＯＬ６Ａ２的单克隆抗体有特异性反应。
　　３结论
　　本实验研究了不同的培养条件对重组蛋白表达的影响，结果表明接种量对重组蛋白表达影响较大，当接种量过大时，会直接影响菌体生长状态，从而抑制重组蛋白的表达；ＩＴＰＧ有毒性，培养基中ＩＰＴＧ浓度过低会使诱导力度不够，蛋白表达少，过高则可能会影响菌体生长；诱导时机和诱导后的培养时间都对目的蛋白的产量有重要的影响。确定了重组蛋白表达的最佳培养条件：接种量为２％，培养３．０ ｈ后添加终浓度为０．５ ｍｍｏｌ／Ｌ的ＩＴＰＧ，３７ ℃下诱导表达５．０ ｈ，表达的重组蛋白含量最高。本研究使用重组质粒ｐＥＴ２２ｂ－ＣＰ６转化的大肠杆菌ｐＣ６－ＢＬ２１（ＤＥ３），经ＩＰＴＧ诱导表达，得到可溶性重组蛋白，经Ｎｉ－ＮＴＡ柱亲和层析纯化获得重组蛋白，方法简单易行。本实验的结果为进一步在发酵罐内进行分批发酵和补料发酵提供了参考。
　　
　　参考文献：
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　　注：本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文
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