[HPLC测定乳制品中三聚氰胺含量]奶粉中三聚氰胺含量测定

　　摘 要：在三聚氰胺的检测中采用沉淀剂沉淀、微波超声、离心分离相结合的方法提取，用高效液相色谱法测定，再用保留时间定性，外标法定量。该方法能有效的排除乳制品中蛋白质、脂肪等大分子物质以及其它含氮物质对检测的影响，最低检测限为1.0mg/kg,回收率为98.0%～102.6%之间，因此能普及到乳制品的检验检测中。
　　关键词：HPLC；乳制品；三聚氰胺
　　三聚氰胺 (melamine) 是一种重要的氮杂环有机化工原料，为白色或无色结晶，通常用于塑料制品中合成树脂的生产，部分亚洲国家也用来制造化肥。三聚氰胺含氮量为66.6%，是蛋白质平均含量的4.16倍，牛奶的151倍，奶粉的23倍。每100g牛奶中添加0.1克三聚氰胺，就能提高0.4%含氮量，因此三聚氰胺也被人称为"蛋白精"。食品工业历来通用的蛋白质测试方法为凯氏定氮法，通过测定总氮来估算蛋白质含量。这种方法只能知道氮的总量，不能识别氮的来源和氮源的种类，正是由于食品和饲料工业蛋白质含量测试方法的缺陷，给不法商人留下了制造伪劣食品的空间，出现了奶粉"三聚氰胺"事件，涉及面之广，性质之恶劣，危害之大到了令人发指的地步。检测三聚氰胺的方法主要有高效液相色谱（HPLC）法、气相色谱-质谱联用法(GC-MS)、ELISA试剂盒法、毛细管电泳法、近红外线吸收检测法等，而高效液相色谱（HPLC）法是一种最普遍而相对简便的方法。通过摸索，结合沉淀剂沉淀、微波超声、离心分离方法，建立一种应用高效液相色谱法测定乳制品中三聚氰胺的方法，其检测达到了很好的效果。
　　1 材料与方法
　　1.1 材料与试剂
　　奶粉、纯牛奶、核桃花生奶、麦香奶、酸牛乳 抽取的检验样品
　　三聚氰胺（标准品，99.5%）、辛烷磺酸钠（色谱纯，99.5%）、乙腈（色谱纯，99.5%）、三氯乙酸（分析纯,99.5%）、乙酸铅（分析纯，99.5%）、柠檬酸（分析纯，99.5%）、甲醇（色谱纯, 99.9%）中国计量科学研究院、国药集团化学试剂有限公司、天津市科密欧化学试剂有限公司。
　　1.2 仪器与设备
　　美国SIII高效液相色谱仪(紫外检测器) 美国 SSI公司；ESJ182.4型电子天平 沈阳龙腾电子有限公司；TG16-WS型台式高速离心机 湖南湘仪实验仪器开发有限公司；BH3300H型超声波清洗器 上海新苗医疗器械制造有限公司 ；UPT-Ⅱ-20T型超纯水机 成都超纯科技有限公司。
　　1.3 方法
　　1.3.1色谱条件和参数
　　色谱柱：Luna 5u-C8 (2) 100A(4.6�?50mm，5�%em不锈钢柱)； 流动相：离子对缓冲液（准确称取2.10g柠檬酸和2.16g辛烷磺酸钠加水溶解后定容至1L）-乙腈（85+15，体积比），混匀；流速：1.0ml/min；柱温：40℃；进样量：50�%el；检测器：紫外检测器；检测波长240nm；灵敏度0.02AUFS。
　　1.3.2标准曲线绘制
　　准确称取100mg(精确到0.1mg)三聚氰胺标准品于100ml容量瓶中，用甲醇水溶液（甲醇：水=1:1）溶解并定容至刻度，配制成浓度为1.0mg/ml的标准储备液，于4℃避光保存。用流动相将三聚氰胺储备液逐级稀释到浓度为0.8、2、20、40、80�%eg/ml的标准工作液，经0.2�%em 滤膜(有机)过滤后由浓度低到高分别取50�%eL 注入色谱仪进行检测，测定峰面积，以峰面积对浓度(�%eg/L)作标准曲线。
　　1.3.3样品处理及测定
　　称取5g固体样品（精确至0.01g）或20g液体样品（精确至0.01g）于50.0ml比色管中，加入2ml 乙酸铅溶液(22g/L)用三氯乙酸溶液（10g/L）定容至50ml刻度。微波超声提取20min,移入离心管中，10000r/min离心5min,吸取上清液，用0.2�%em的微孔滤膜(有机)过滤，滤液待上机使用。取 50�%eL注入色谱仪中 ,测定峰面积，根据保留时间定性，外标峰面积定量。
　　1.3.4结果计算
　　试样中三聚氰胺的含量按式(1)进行计算：
　　X=�譮
　　式中：
　　X --试样中三聚氰胺含量，单位为毫克每千克（mg/kg）；
　　A --试样溶液中三聚氰胺的峰面积；
　　A, --标准溶液中三聚氰胺的峰面积；
　　C --标准溶液中三聚氰胺的浓度，单位为微克每毫升（�%eg/mL）；
　　V --试样最终定容体积，单位为毫升(mL) ；
　　m --试样的质量，单位为克（g）；
　　f --稀释倍数。
　　2 结果与分析
　　2.1 前处理分析
　　乳制品中的蛋白质等一些有机大分子物质，分子大、不溶于水，在过滤中容易堵塞滤膜，从而使得过滤时间长、处理效果不佳、色谱柱极易被堵塞。实验证明加入沉淀剂、微波超声、高速离心可以使检测结果更加准确而且极大的缩短了过滤时间，这对高效的完成检验检测工作具有重要的意义。由表1可得只有加入沉淀剂、微波超声、高速离心相结合时才能达到最佳的处理效果。
　　表1：不同前处理后过滤2ml分析液的时间
　　Table 1：The consuming time of obtaining 2 mL filtrate with different pretreatments
　　2.2 检出限
　　以样品被测组分峰高为基线噪音3 倍时的浓度为最低检出浓度，三聚氰胺的检出限为1.0mg/kg。
　　2.3 加标回收率实验
　　四种样品不同浓度加标三聚氰胺的回收率为98.0%～102.6% ，表2充分的说明了加标回收率范围。
　　2.5 样品测定分析
　　奶粉中加入三聚氰胺的现象相对比较多，实验中选取了一加入三聚氰胺的奶粉，图1是奶粉中检测出三聚氰胺的谱图，对该样品做加标回收其检测的加标回收率为102.3%，完全符合最佳的加标回收率范围（90%～110%）。同时对该样品在前处理的过程中用固相萃取柱进行洗涤、洗脱、净化后检测，并且和高一级的实验室中气相色谱-质谱联用法(GC-MS)进行了比对，其检测结果和以上检测结果一样。可以充分说明检测的效果良好，能够全面的应用到实验室检验检测中。
　　3 结 论
　　本文建立了一种简便、快速、高效的利用液相色谱法检测乳制品中的三聚氰胺，很好的排除了蛋白质、脂肪以及其它含氮物质等因素的影响，简化了检验检测的复杂过程，使其检测技术容易掌握，检测结果准确。在日常的检验检测工作中具有很强的实用性和高效性。
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　　作者简介：任兴权（1984-），男，助理工程师，硕士，主要从事食品、化工、轻工分析检验与研究;李万润（1984-），男，助理工程师，学士，主要从事特种设备检测与研究。