抗速灭威噬菌体单链抗体库的构建\筛选及鉴定_t2噬菌体dna是单链吗

　　摘要：以速灭威抗原免疫的小鼠为实验对象，取其脾细胞，ＲＴ－ＰＣＲ扩增抗体重链可变区（ＶＨ）和轻链可变区（ＶＬ）基因，重叠延伸ＰＣＲ拼接单链抗体（ＳｃＦｖ）基因，克隆入噬菌粒表达载体ｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅ并转化大肠杆菌ＴＧ１，成功构建了库容约７．６×１０５的抗速灭威噬菌体ScFv库。对该文库进行了５轮“吸附-洗脱-扩增”的富集筛选，获得了６个特异性较强的抗速灭威噬菌体ＳｃＦｖ阳性克隆。其研究结果为速灭威特异性抗体的大量制备奠定了一定的基础。
　　关键词：速灭威；单链抗体；噬菌体展示
　　中图分类号：Ｑ８１９ 文献标识码：Ａ 文章编号：0439－８114（２０11）09－1908-05
　　
　　Construction，Screening and Identification of Phage ScFv Library Against Metolcarb
　　
　　ＬＩ Ｔｉｅ－ｊｕｎ１，ＬＩ Ｄｅ－ｑｕａｎ２
　　（１． Ｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｎａｎｔｏｎｇ Ｖｏｃａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｎａｎｔｏｎｇ ２２６００７，Ｊｉａｎｇｓｕ，Ｃｈｉｎａ；
　　２． Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｌｉｆｅ ａｎｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｎａｎｔｏｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｔｏｎｇ ２２６００７，Ｊｉａｎｇｓｕ，Ｃｈｉｎａ）
　　
　　Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｂａｌｂ／Ｃ ｍｉｃｅ ｗｅｒｅ ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ ｗｉｔｈ ａ ｈａｐｔｅｎ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ ｏｆ Ｍｅｔｏｌｃａｒｂ， ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｓｐｌｅｅｎ ｃｅｌｌｓ ｗｅｒｅ ｈａｒｖｅｓｔｅｄ． ＶＨ ａｎｄ ＶＬ ｇｅｎｅｓ ｗｅｒｅ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｂｙ ＲＴ－ＰＣＲ． ＶＨ ａｎｄ ＶＬ ｗｅｒｅ matched into ScFc by overlap extension PCR， ａｎｄ ｃｌｏｎｅｄ ｉｎｔｏ ｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ， ａｎｄ ｔｈｅｎ ｔｒａｎｓｆｏｒｍed ＴＧ１ ｃｅｌｌｓ． Ｔｈｕｓ ｔｈｅ ｐｈａｇｅ ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎ Ｆｖ（ＳｃＦｖ） ｌｉｂｒａｒｙ ｗｉｔｈ ａ ｓｉｚｅ ｏｆ ａｂｏｕｔ ７．６×１０５ was ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ． Ｔｈｅ ｌｉｂｒａｒｙ ｗａｓ ｂｉｏｐａｎｎｅｄ ｂｙ ５ ｒｏｕｎｄｓ ｏｆ ｂｉｎｄｉｎｇ－ｅｌｕｔｉｏｎ－ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ； ａｎｄ ６ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｌｏｎｅｓ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｆｏｒ Ｍｅｔｏｌｃａｒｂ ｗｅｒｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｔｈｅ ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｌａｒｇｅ－ｓｃａｌｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｇａｉｎｓｔ Ｍｅｔｏｌｃａｒｂ．
　　Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｍｅｔｏｌｃａｒｂ；ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ Ｆｖ（SｃＦｖ）； ｐｈａｇｅ－ｄｉｓｐｌａｙ
　　速灭威（Ｍｅｔｏｌｃａｒｂ，３－甲苯基－Ｎ－甲基氨基甲酸酯）是氨基甲酸酯类杀虫剂，具有触杀和熏蒸作用，主要用于稻田、蔬菜、水果及经济作物等的害虫防治。虽然速灭威为中等毒杀虫剂，但农产品上残留的速灭威仍会对人体健康造成潜在的危害，有必要对其进行持续的监控检测［１］。
　　目前定量分析速灭威残留的主要方法是气相色谱（ＧＣ）和高效液相色谱（ＨＰＬＣ）等仪器分析法，但这些方法必须对样品进行步骤冗长的纯化处理，很难达到快速、简便的现场检测要求；与仪器分析相比，免疫分析法具有快速、简单、灵敏、价廉等优点，可用于现场快速检测，具有广阔的应用前景和开发潜力［２］。
　　抗体作为免疫分析的核心试剂，其制备技术一直是制约免疫分析法在农药残留分析领域应用的瓶颈因素。与传统的多抗和单抗制备技术相比，第三代抗体制备技术――噬菌体抗体库技术具有基因型与表型相统一、选择与扩增相统一的优点，它不仅可以绕过繁琐的杂交瘤制备过程，甚至可以省略动物免疫的步骤，使得建立各种文库以及体外筛选任何目的分子的重组抗体成为可能［３］。因此，噬菌体抗体库技术为化学农药抗体的制备开拓了新的思路。
　　本研究利用噬菌体展示技术，构建抗速灭威噬菌体ＳｃＦｖ库，从中筛选与速灭威特异性结合的噬菌体ＳｃＦｖ阳性克隆，为进一步实现速灭威免疫快速检测提供大量制备特异性抗体的新途径。目前，国内外有关速灭威ＳｃＦｖ制备的研究尚未见报道。
　　１材料与方法
　　１．１材料
　　１．１．１实验动物ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，雌性，６周龄，由南通大学实验动物中心提供。
　　１．１．２主要试剂速灭威免疫原ＨＯＭ－ＢＳＡ和包被抗原ＨＯＭ－ＯＶＡ参照文献［２］的步骤合成；弗氏完全佐剂与弗氏不完全佐剂购自Ｓｉｇｍａ公司；Ｔｒｉｚｏｌ试剂购自Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司；ｒＴａｑ ＤＮＡ聚合酶、限制性内切酶、Ｔ４ ＤＮＡ连接酶、ＤＮＡ凝胶回收试剂盒、质粒抽提试剂盒购自ＴａＫａＲａ公司；ｍＲＮＡ纯化试剂盒、Ｅ． ｃｏｌｉ ＴＧ１、ｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅ、Ｍ１３ＫＯ７辅助噬菌体、ＳｃＦｖ构建试剂盒、重组噬菌体筛选试剂盒购自Ｐｈａｒｍａｃｉａ公司；蛋白胨、酵母提取物购自Ｏｘｏｉｄ公司；ＴＭＢ（３，３′，５，５′－四甲基联苯胺）由中国华美生物工程公司进口分装；其余基本试剂均为分析纯。
　　１．２方法
　　１．２．１动物免疫及ｍＲＮＡ的分离免疫原ＨＯＭ－ＢＳＡ与等量弗氏完全佐剂混合，对小鼠腹腔注射进行免疫。换不完全佐剂，隔２周加强一次，共加强５次，取小鼠脾脏前３ ｄ再用ＨＯＭ－ＢＳＡ加强免疫一次，采用酶联免疫吸附测定（ＥＬＩＳＡ）法检验抗体滴度，取免疫效果好的小鼠脾脏以Ｔｒｉｚｏｌ试剂提取总ＲＮＡ，经Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）纤维素层析柱分离得ｍＲＮＡ。
　　１．２．２ＶＨ，ＶＬ 基因扩增以ｍＲＮＡ为模板，在鼠源反转录酶催化下，以随机六聚体为引物合成ｃＤＮＡ第一链，用小鼠抗体重、轻链可变区特异性引物，ＰＣＲ扩增ＶＨ和ＶＬ基因。将ＰＣＲ产物进行１．５％琼脂糖凝胶电泳，用ＤＮＡ凝胶回收试剂盒回收目的基因片段。
　　１．２．３ＳｃＦｖ基因的克隆纯化回收的ＶＨ、ＶＬ基因片段与Ｌｉｎｋｅｒ Ｐｒｉｍｅｒ Ｍｉｘ以等摩尔浓度混合，进行重叠延伸ＰＣＲ反应。ＰＣＲ反应参数为９４℃、１ ｍｉｎ，６３℃、４ ｍｉｎ，进行７个循环后延伸５ ｍｉｎ，从而将ＶＨ、ＶＬ基因随机拼接成ＳｃＦｖ，再继续进行３０次循环，反应条件为９４℃、１ ｍｉｎ，５５℃、２ ｍｉｎ，７２℃、２ ｍｉｎ，循环结束后，７２℃延伸１０ ｍｉｎ。将ＰＣＲ 产物进行１．５％琼脂糖凝胶电泳，用ＤＮＡ凝胶回收试剂盒回收目的基因片段。
　　１．２．４抗速灭威噬菌体ＳｃＦｖ库的构建将纯化的ＳｃＦｖ片段用ＳｆｉⅠ、ＮｏｔⅠ双酶切，与经同种双酶预切的ｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅ噬菌粒载体连接，转化感受态
　　Ｅ． ｃｏｌｉ ＴＧ１，铺板后，３０℃过夜培养，计算重组子数，估计库容。随机挑取文库的重组子，提取质粒后ＰＣＲ扩增ＳｃＦｖ基因片段，电泳回收后的ＳｃＦｖ基因片段用ＢｓｔＮⅠ酶切消化，４％琼脂糖凝胶电泳分析酶切指纹图谱，进行文库多样性分析，同时对提取的质粒进行Ｈｉｎ ｄⅢ、Ｅｃｏ ＲⅠ双酶切鉴定。其余菌落用２×ＹＴ液体培养基冲刮并收集，加入氨苄青霉素至１０５μｇ／Ｌ、葡萄糖至２％，并加入Ｍ１３ＫＯ７辅助噬菌体超感染，３７℃振荡培养１ ｈ后，离心沉淀菌体，用２×ＹＴ－ＡＫ液体培养基悬浮，３７℃振荡培养过夜，离心沉淀菌体细胞，上清即为抗速灭威噬菌体ＳｃＦｖ库。
本文为全文原貌 未安装PDF浏览器用户请先下载安装 原版全文 　　１．２．５抗速灭威噬菌体ＳｃＦｖ库的富集筛选
　　１）第一轮富集筛选。参照文献［４］的步骤进行第一轮富集筛选。在进行第一轮筛选时，降低筛选强度可避免有价值的稀有噬菌体重组子的丢失。本研究第一轮包被抗原ＨＯＭ－ＯＶＡ的浓度为５０.0 μｇ／ｍＬ，噬菌体ＳｃＦｖ的非特异性洗脱次数为１０次。筛选结束取１０ μＬ已感染重组噬菌体的细菌培养物作６次１０倍稀释，１００ μＬ／ＳＯＢＡＧ平板，３０℃温箱培养过夜，测定噬菌体ＳｃＦｖ滴度，计算噬菌体的回收率，分析亲和富集效果。
　　２）后四轮富集筛选。第二、三、四、五轮筛选抗原的包被浓度依次为５．０、３．０、１．０、０．５ μｇ／ｍＬ，第二轮以后的噬菌体ＳｃＦｖ的非特异性洗脱次数为２０次，其余步骤同第一轮。
　　３）多克隆噬菌体ＥＬＩＳＡ。采用多克隆噬菌体ＥＬＩＳＡ分析各轮吸光度值变化可初步鉴定每轮富集筛选的效果。①将包被抗原ＨＯＭ－ＯＶＡ用０．０５ ｍｏｌ／Ｌ碳酸盐包被缓冲液（ｐＨ值为９．６）稀释为１０ μｇ／ｍＬ，９６孔酶标板１００ μＬ／孔包被，４℃过夜；②去包被液，ＰＢＳ缓冲液洗涤３次，３％脱脂奶粉（ＰＢＳ缓冲液配置）２００ μＬ／孔，３７℃封闭２ｈ；③去封闭液，ＰＢＳ缓冲液洗涤３次，每轮筛选后，分别取相同滴度（５×１０９ PFU／ｍＬ）、ＰＥＧ／ＮａＣｌ沉淀获得的噬菌体ＳｃＦｖ与等体积３％的脱脂奶粉（ＰＢＳ缓冲液配置）混匀，１００ μＬ／孔，３７℃孵育２ ｈ，阴性对照为相同滴度扩建的原始噬菌体ＳｃＦｖ库；④去噬菌体悬液，以０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０－ＰＢＳ洗涤６次；酶标二抗ＨＲＰ／Ａｎｔｉ－Ｍ１３用３％脱脂奶粉（ＰＢＳ缓冲液配置）做１∶１０ ０００的稀释，１００ μＬ／孔，３７℃孵育１ｈ；⑤弃去溶液，以０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０－ＰＢＳ洗涤６次，加入ＴＭＢ显色液１００ μＬ／孔，３７ ℃孵育１０ ｍｉｎ；⑥５０ μＬ ２ｍｏｌ／Ｌ Ｈ２ＳＯ４／孔终止反应；⑦酶联仪测定ＯＤ４５０ｎｍ值。
　　４）单克隆噬菌体ＥＬＩＳＡ。随机挑选第三、四、五轮经ＰＣＲ和酶切验证的重组子制备单克隆噬菌体ＳｃＦｖ；取相同滴度的单克隆噬菌体ＳｃＦｖ参照上述多克隆噬菌体ＥＬＩＳＡ步骤进行检测，阳性判定的标准为ＯＤ值大于等于阴性对照孔的２．１倍；通过计算每轮筛选的单克隆噬菌体ＳｃＦｖ的阳性率来鉴定富集筛选效率。
　　１．２．６高亲和力高特异性抗速灭威噬菌体ＳｃＦｖ的筛选
　　１）单克隆噬菌体ＥＬＩＳＡ筛选试验。①抗体库经五轮富集筛选后，将最后一轮筛选后的涂布在ＳＯＢＡＧ平板上，分批挑选经ＰＣＲ及酶切验证含重组噬菌粒的重组子制备单克隆噬菌体ＳｃＦｖ；②取相同滴度的噬菌体ＳｃＦｖ进行单克隆噬菌体ＥＬＩＳＡ筛选试验，阴性对照孔为相同滴度用空载体转化菌扩增的Ｍ１３Ｋ０７；③取ＥＬＩＳＡ吸光度值高的阳性克隆进行下一步竞争抑制试验，阳性判定的标准为ＯＤ值大于等于阴性对照孔的２．１倍。
　　２）竞争抑制试验。采用游离的速灭威原药进行单克隆噬菌体ＥＬＩＳＡ竞争抑制试验可进一步排除具高亲和力的非特异性阳性克隆。将５０ μＬ用３％脱脂奶粉（ＰＢＳ缓冲液配置）稀释的噬菌体抗体（５×１０１０PFU／ｍＬ）与５０ μＬ不同浓度的（１、１０、１００ μｇ／ｍＬ）速灭威原药（用３％脱脂奶粉１０倍稀释）３７℃孵育３０ ｍｉｎ，使抗原抗体充分反应，其余操作同上述多克隆噬菌体ＥＬＩＳＡ；计算抑制率，分析竞争抑制效果。抑制率＝（未加速灭威的ＯＤ４５０ nm－加入速灭威的ＯＤ４５０ nm）／未加速灭威的ＯＤ４５０ nm×１００％。
　　２结果与分析
　　２．１抗体基因ＰＣＲ产物的鉴定
　　用１．５％琼脂糖凝胶电泳检测ＰＣＲ产物，结果显示扩增出的ＶＨ和ＶＬ基因片段分别约为３４０ ｂｐ和３２０ ｂｐ（图１），重叠延伸ＰＣＲ后，获得扩增产物约为７5０ ｂｐ的ＳｃＦｖ基因（图２），与预期的片段大小相符。
　　
　　２．２抗速灭威噬菌体ＳｃＦｖ库的构建
　　ＳｃＦｖ基因片段经酶切、连接后，转化Ｅ． ｃｏｌｉ ＴＧ１感受态细胞。重组子在氨苄青霉素选择性培养基上生长旺盛，连接产物的载体转化率约为４．５×１０５／μｇ载体。为了增加抗体库容量，本研究将每４０ μＬ感受态细胞与４ μＬ连接产物混匀后电转，共进行了４０次连接和８０次转化反应来构建抗速灭威噬菌体ＳｃＦｖ库。经计数，长出的重组子总数约为７．６×１０５，而以未转化的ＴＧ１感受态细胞涂布的平板则没有重组子长出。
　　２．３抗速灭威噬菌体ＳｃＦｖ库的鉴定
　　２．３．１重组子的ＰＣＲ鉴定以随机挑选的重组子的质粒为模板，均能扩增出分子量大小约７５０ ｂｐ的ＤＮＡ片段（图３）。
　　
　　２．３．２重组子的双酶切鉴定对ＰＣＲ鉴定结果为阳性的重组噬菌粒进行Ｈｉｎ ｄⅢ、Ｅｃｏ ＲⅠ双酶切鉴定，电泳结果显示均被切成约２ １１１ ｂｐ和３ １１１ ｂｐ的两个条带（图４），表明有外源基因插入片段，连接转化成功。
　　
　　２．３．３文库的多样性分析由于ＢｓｔＮⅠ的切割位点［５′－ＣＣ（Ａ／Ｔ）ＧＧ－３′］在免疫球蛋白的可变区基因中大量的存在，因此可用ＢｓｔＮ Ｉ酶切来间接鉴定文库的多样性［５］。本试验从文库中随机挑取的重组子的ＳｃＦｖ基因片段经ＢｓｔＮ Ｉ酶切后的指纹谱型各不相同（图略），说明文库的多样性好、实际有效性有保障，该抗体库的库容量约７．６×１０５。
　　２．４抗速灭威噬菌体ＳｃＦｖ库的富集筛选
　　以速灭威人工抗原ＨＯＭ－ＯＶＡ对抗速灭威噬菌体ＳｃＦｖ库进行了５轮“吸附-洗脱-扩增”的富集筛选。通过降低抗原包被浓度和增强洗脱力度的方法逐渐洗去了非特异性吸附的噬菌体ＳｃＦｖ。经测定，噬菌体第一、二、三、四、五轮的回收率分别为１．０×１０－４％、１．１×１０－５％、２．６×１０－４％、５．９×１０－４％、５．６×１０－４％，总体上显示了一个增加的趋势，说明特异性的噬菌体ＳｃＦｖ得到了有效富集。
　　２．５富集筛选效果的分析鉴定
　　２．５．１多克隆噬菌体ＥＬＩＳＡ的初步分析５轮洗脱液扩增的噬菌体ＳｃＦｖ各取５×１０９PFU／ｍＬ进行多克隆噬菌体ＥＬＩＳＡ检测，其ＯＤ４５０ nm值逐轮增高，分别为第一轮０．１０７±０．０１0、第二轮０．１４３±０．０２0、第三轮０．２８２±０．０２0、第四轮０．４３１±０．０１0、第五轮０．５３３±０．０２0，而阴性对照（原库扩增产物）ＯＤ４５０ nm值为０．０７６±０．０１０。结果显示，从第三轮开始，ＯＤ４５０ nm值已为阴性对照的２．１倍以上，说明各轮富集筛选有效。
　　２．５．２重组子的ＰＣＲ鉴定经过对第三、四、五轮富集筛选后ＳＯＢＡＧ平板菌的菌落ＰＣＲ鉴定，每轮随机挑选的２０个重组子均能扩增出大小约７５０ ｂｐ的片段（图略），不存在插入子片段缺失的现象。
　　２．５．３重组子的双酶切鉴定选ＰＣＲ鉴定结果为阳性的噬菌粒进行Ｈｉｎ ｄⅢ、Ｅｃｏ ＲⅠ双酶切鉴定，电泳结果显示均被切成约２ １１１ ｂｐ和３ １１１ ｂｐ两个条带（图略），证明富集筛选过程中插入的ＳｃＦｖ片段没有丢失。
　　２．５．４筛选效率的比较对上述第三、四、五各轮随机挑选的２０个经ＰＣＲ和酶切鉴定的重组子进行单克隆噬菌体ＥＬＩＳＡ检测，结果显示，第三、四、五轮的阳性率分别为３５％、６５％、８０％，第三、四、五轮的Ｐ／Ｎ均值分别为２．３２、３．２１、４．４１，说明本试验富集筛选效率较高。
本文为全文原貌 未安装PDF浏览器用户请先下载安装 原版全文 　　２．６单克隆噬菌体ＥＬＩＳＡ筛选高亲和力阳性克隆
　　从第五轮筛选后得到的细菌集落中分批随机挑选大量重组子，以未经筛选的噬菌体初级库为对照，单克隆噬菌体ＥＬＩＳＡ测定这些重组子的噬菌体ＳｃＦｖ与ＨＯＭ－ＯＶＡ的结合活性，从中筛选出２０个Ｐ／Ｎ值达到４．００以上的高亲和力阳性克隆。
　　２．７阳性克隆竞争抑制试验结果
　　为了排除假阳性发生，对上述２０个阳性克隆进行竞争抑制反应，竞争抑制结果显示：当抗原包被浓度为５.0 μｇ／ｍＬ、噬菌体滴度为５×１０１０PFU／ｍＬ时，有６个阳性克隆对速灭威的识别作用明显（表１），竞争抑制反应体系中速灭威浓度为１０ μｇ／ｍＬ时，抑制率均达到２０％以上。
　　
　　３讨论
　　抗速灭威噬菌体ＳｃＦｖ库的多样性是获得特异性噬菌体ＳｃＦｖ及分泌表达单链抗体的关键所在。为了能最大限度地获得抗体可变区基因，保持文库的多样性，我们采取了以下措施：①扩增小鼠重链、轻链基因时采用的ＰＣＲ引物套组是根据抗体可变区基因上、下游相对保守的骨架区设计的，理论上该套引物能结合数百个Ｖ片段中的任何一个以及６个Ｊ片段中的任何一个，有较好的通用性，可确保ＳｃＦｖ文库能最大限度地保持小鼠体内Ｂ细胞克隆的多样性，这是保证抗体库容量的基础［６］。②在试验中加大了ＶＨ、ＶＬ的原始用量（由ｃＤＮＡ 扩增得到的ＶＨ、ＶＬ）；尽管操作手册建议用ＰＣＲ产物再扩增，但扩增后仅仅增加了基因的量，抗体库中基因的多样性并没有增加；因此研究中我们采用了混合多次、由ｃＤＮＡ直接扩增得到的ＶＨ、ＶＬ ＰＣＲ产物的方法来保证其所用量。ＢｓｔＮ Ｉ酶切指纹图谱分析表明，本研究所构建的免疫抗体库具有良好的多样性分布，库容量为７．６×１０５。
　　噬菌体ＳｃＦｖ库的筛选，需要对许多条件进行优化，包括噬菌体的制备及其滴度，但更重要的是要优化筛选策略。本研究我们通过降低抗原浓度、增强洗脱力度的方法逐渐富集与之特异性高亲和力高的噬菌体。①利用抗原浓度递减的梯度式筛选。因为第一轮淘选时，阳性克隆在抗体库中的比例和数量很低，若选择强度过高，极易导致阳性克隆的丢失，且在后几轮的淘选中将无法弥补。经过第一轮的淘选后，阳性克隆获得了一次富集和扩增，数量和比例均得以大幅度提升，因此在随后的淘选中，即使提高严谨度，阳性克隆也不易丢失。②确定筛选轮数。筛选轮数过少，特异性噬菌体ＳｃＦｖ不能高度富集，筛选轮数过多，产出率会降低。有研究证明，重复５次筛选效果较好［７，８］。本研究为了得到特异性高的噬菌体抗体，共经过了５轮严格的“吸附-洗脱-扩增”淘洗过程。③确定洗涤次数。本研究第一轮筛选洗涤１０次，可将非特异性噬菌体和辅助噬菌体洗去，第二轮以后洗涤２０次，可除去亲合力低的噬菌体ＳｃＦｖ，得到高亲合力的噬菌体ＳｃＦｖ。噬菌体回收率及ＥＬＩＳＡ鉴定结果显示，上述筛选策略是较为成功的。
　　本研究通过５轮“吸附-洗脱-扩增”的过程，观察到了特异性噬菌体ＳｃＦｖ的富集，但是，富集程度与国外文献报道的相比有一定的差距，筛选出的阳性克隆比例亦低于文献报道［９］。分析原因可能为：用单一纯化抗原免疫小鼠构建的文库通用性差、容量偏小，Ｂ细胞中原始的重轻链之间的组配（Ｐａｉｒｉｎｇ）可能发生了丢失。理论研究表明文库容量越大筛选任意抗原表位的抗体的机率就越大，发现高亲合力噬菌体ＳｃＦｖ的可能性也会有所增加［１０－１２］。诚然，经过一系列的筛选虽然获得了６个有一定特异性的噬菌体ＳｃＦｖ，但我们应该看到这些阳性克隆的亲和活性仅仅是分泌型噬菌体ＳｃＦｖ所表现的活性，而且，噬菌体外壳蛋白对ＳｃＦｖ的活性还存在一定的影响，因此，关于这些阳性克隆的应用前景仍有待于对可溶性ＳｃＦｖ特性的进一步研究加以验证。
　　４结论
　　本研究以速灭威抗原免疫的小鼠为试验对象，成功构建了库容约７．６×１０５的抗速灭威噬菌体ＳｃＦｖ库，通过对该文库的５轮“吸附-洗脱-扩增”的富集筛选，获得了６个特异性较强的抗速灭威噬菌体ＳｃＦｖ阳性克隆。本研究结果为速灭威特异性抗体的大量制备奠定了一定的基础，对开发其他化学农药的重组抗体具有重要的理论价值和实践意义。
　　参考文献：
　　［１］ 孙晶玮，王硕，张燕． 氨基甲酸酯类农药速灭威人工抗原的合成与鉴定［Ｊ］． 现代食品科技，２００９，２５（１０）：１１８３－１１８５．
　　［２］ 张奇，李铁军，朱晓霞，等． 氨基甲酸酯类杀虫剂速灭威酶联免疫吸附分析方法研究［Ｊ］． 分析化学，２００６，３４（２）：１７８－１８２．
　　［３］ 潘科，王弘，张宏斌，等． 抗克伦特罗噬菌体－ＳｃＦｖ库的构建、筛选及鉴定［Ｊ］． 华南理工大学学报（自然科学版），２００５，
　　３３（１１）：５１－５４．
　　［４］ 甄永苏，邵荣光． 抗体工程药物［Ｍ］． 北京：化学工业出版社，２００２．
　　［５］ ＬＩ Ｙ，ＣＯＣＫＢＵＲＮ Ｗ，ＫＩＬＰＡＴＲＩＣＫ Ｊ Ｂ，ｅｔ ａｌ． Ｈｉｇｈ ａｆｆｉｎｉｔｙ ＳｃＦｖｓ ｆｒｏｍ ａ ｓｉｎｇｌｅ ｒａｂｂｉｔ ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ ｗｉｔｈ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｈａｐｔｅｎｓ［Ｊ］． Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍ，２０００，２６８（２）：３９８－４０４．
　　［６］ ＯＲＬＡＮＤＩ Ｒ，ＧＵＳＳＯＷ Ｄ Ｈ，ＪＯＮＥＳ Ｐ Ｔ，ｅｔ ａｌ． Ｃｌｏｎｉｎｇ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎｓ ｆｏｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｂｙ ｔｈｅ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ［Ｊ］． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，１９８９，８６（１０）：３８３３．
　　［７］ 王琐，化冰，刘群英，等． 半合成抗体库的构建及鉴定［Ｊ］． 中华微生物学和免疫学杂志，１９９９，１９（３）：２３８－２４１．
　　［８］ 侯颖春，杨为松，白雪帆，等． 人源性汉坦病毒噬菌体抗体基因的筛选、测序和表达［Ｊ］． 中华微生物学和免疫学杂志，１９９９，
　　１９（１）：３８－４１．
　　［９］ ＳＨＥＮＬＡＮ Ｍ， ＣＨＡＮＧＳＨＯＵ Ｇ， ＣＨＩＨ－ＨＵＮＧ Ｌ， ｅｔ ａｌ． Ｐｈａｇｅ－ｄｉｓｐｌａｙ ｌｉｂｒａｒｙ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｉｇｈ－ａｆｆｉｎｉｔｙ ｈｕｍａｎ ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｏ ｔｕｍｏｒ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ ａｎｔｉｇｅｎｓ ｓｉａｌｙｌ Ｌｅｗｉｓｘ ａｎｄ Ｌｅｗｉｓｘ［Ｊ］． Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， １９９９， ９６（１２）：６９５３－６９５８．
　　［１０］ ＤＥ ＨＡＡＲＤ Ｈ Ｊ，ＶＡＮ ＮＥＥＲ Ｎ，ＲＥＵＲＳ Ａ，ｅｔ ａｌ． Ａ ｌａｒｇｅ ｎｏｎ－ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ ｈｕｍａｎ ｆａｂ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｐｈａｇｅ ｌｉｂｒａｒｙ ｔｈａｔ ｐｅｒｍｉｔｓ ｒａｐｉｄ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｋｉｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｈｉｇｈ ａｆｆｉｎｉｔｙ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ［Ｊ］． Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，１９９９，２７４：１８２１８－１８２３０．
　　［１１］ ＶＡＵＧＨＡＮ Ｔ Ｊ，ＷＩＬＬＩＡＭＳ Ａ Ｊ，ＰＲＩＴＣＨＡＲＤ Ｋ，ｅｔ ａｌ． Ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｗｉｔｈ ｓｕｂｎａｎｏｍｏｌａｒ ａｆｆｉｎｉｔｉｅｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ａ ｌａｒｇｅ ｎｏｎ－ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ ｌｉｂｒａｒｙ［Ｊ］． Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１９９６，１４：３０９－３１４．
　　［１２］ ＳＨＥＥＴＳ Ｍ Ｄ，ＡＭＥＲＳＤＯＲＦＥＲ Ｐ，ＦＩＮＮＥＲＮ Ｒ，ｅｔ ａｌ． Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｌａｒｇｅ ｎｏｎｉｍｍｕｎｅ ｐｈａｇｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｌｉｂｒａｒｙ：Ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｉｇｈ－ａｆｆｉｎｉｔｙ ｈｕｍａｎ ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｏ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｔｉｇｅｎｓ［Ｊ］． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９９８，９５（１１）：６１５７－６１６２．
本文为全文原貌 未安装PDF浏览器用户请先下载安装 原版全文