sds凝胶电泳配胶 双向凝胶电泳缺陷胶及其原因

ＬＥＴＴＥＲＳＩＮＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹＶｏｌ．１９Ｎｏ．４Ｊｕｌ．，２００８

文章编号：１００９－０００２（２００８）０４－０５６９－０３

生物技术通讯

５６９

技术方法

双向凝胶电泳缺陷胶及其原因

王鸿丽，刘锋，赵永强，李萍，杨松成，魏开华

国家生物医学分析中心，北京１００８５０［摘要］

双向凝胶电泳是蛋白质组学研究中的关键技术之一，涉及较多的实验步骤和试剂，常出现缺陷胶而导致实验失

败。从数千张电泳胶图中选取了２１张典型的缺陷胶图，对它们进行了归类和总结，分析和讨论了形成缺陷胶的多种原因，提出了实验改进的方法和注意事项。［关键词］

双向电泳；缺陷胶；蛋白质组学

［中图分类号］

Ｑ５０３［文献标识码］Ａ

ＡｎａｌｙｓｉｓｏｆＤｅｆｅｃｔＧｅｌｓｉｎ２ＤＧｅｌＥｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ

ＷＡＮＧＨｏｎｇ－Ｌｉ，ＬＩＵＦｅｎｇ，ＺＨＡＯＹｏｎｇ－Ｑｉａｎｇ，ＬＩＰｉｎｇ，ＹＡＮＧＳｏｎｇ－Ｃｈｅｎｇ，ＷＥＩＫａｉ－Ｈｕａ

ＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒｏｆＢｉｏｍｅｄｉｃａｌＡｎａｌｙｓｉｓ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１００８５０，Ｃｈｉｎａ

［Ａｂｓｔｒａｃｔ］

Ｔｗｏ－ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ（２ＤＥ）ｉｓａｋｅｙｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｆｏｒｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，ｈｏｗｅｖｅｒ，ｉｔｏｆｔｅｎｅｎｄｅｄｉｎｄｅ－

Ｍｉｓｔａｋｅｓａｒｅｅａｓｙｔｏｍａｋｅｂｅｃａｕｓｅｓｏｍａｎｙｓｔｅｐｓａｎｄｍａｔｅｒｉａｌｓａｒｅｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎｏｐｅｒａｔｉｏｎ．

ｆｅｃｔｇｅｌｓｉｎｒｅａｌｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ．ｗｅｒｅｐｒｏｐｏｓｅｄｈｅｒｅ．

［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］

Ｔｗｅｎｔｙ－ｏｎｅｐｉｃｔｕｒｅｓｏｆｔｙｐｉｃａｌｄｅｆｅｃｔｇｅｌｓｗｅｒｅｃｈｏｓｅｎａｎｄｃｌａｓｓｉｆｉｅｄ，ｐｏｓｓｉｂｌｅｒｅａｓｏｎｓｗｅｒｅｄｉｓｃｕｓｓｅｄ，ａｎｄｓｏｍｅｍｅｔｈｏｄｓ

ｔｗｏ－ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓRｄｅｆｅｃｔｇｅｌRｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ

蛋白质构型和电荷状态的改变可能会使它们沉淀出来，导致第二向胶上这些蛋白斑点数减少；不同上样方式对蛋白斑点数目有影响。

样品准确定量是双向电泳前的一项重要工作，是保证实验高重复性的重要步骤，以５～１５μｇ／μＬ的总蛋白浓度为宜。蛋白提取包括蛋白质溶解、二硫键还原、变性解聚等步骤，溶解度差的蛋白须加入一些增溶剂和表面活性剂等，以增加溶解度，提高蛋白质的提取率［２］。蛋白上样量较大时，杯式上样的图谱斑点数较常规上样方式多［３］。

双向凝胶电泳（ｔｗｏ－ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，２ＤＥ）是蛋白质组学的经典分离方法，它利用蛋白质等电点和相对分子质量的不同而将混合蛋白质分开，具有结果直观、分辨率较高、技术成熟等优点。从２ＤＥ图上，我们可获得细胞、组织等生物体中蛋白质的表达谱及差异谱，配合适当的显示技术，还可简便地获得蛋白质的修饰谱［１］。但是，双向电泳操作繁琐、涉及试剂多、缺陷胶（ｄｅｆｅｃｔ劳动强度大，容易出现一些异常的电泳结果，即“

或“坏胶（ｂａｄｇｅｌ）”。已有许多文献报道了产生缺陷胶的原ｇｅｌ）”

我们从数千份２ＤＥ图谱中归纳出９类最常因，但大都非常笼统。

见的缺陷胶，并对其形成原因进行了分析。

２．２蛋白斑点堆积

上样量过大可使相对分子质量和等电点相近的蛋白质斑点

１具有代表性的缺陷胶图谱

从近几年的２ＤＥ图谱中收集、整理出２１张具有代表性的缺

部分重叠或堆积（图１Ｅ）；胶条上某个区域溶胀不充分或在操作过程中损坏，会导致该区域没有蛋白质聚焦或蛋白质堆积（图

１Ｆ）；样品中盐离子浓度过高，没有达到预期电压，聚焦不够［４］；胶

条选择不合适。

双向电泳样品最佳的盐浓度是１０ｍｍｏｌ／Ｌ左右，最高不宜超过５０ｍｍｏｌ／Ｌ，常用透析除去盐成分，对于稍低浓度的盐可用水浸湿的滤纸作为盐桥。根据样品的实际情况合理选择胶条，窄范围ｐＨ梯度的胶条可以提高分辨率和灵敏度［５］。

某些样品如结核杆菌含有较多的多糖，这些多糖可以与载体两性电解质及蛋白质发生亲和作用，干扰胶上蛋白点的分离并产生条纹（图１Ｇ），提取此类蛋白时建议采用净化试剂盒进行处理。

［收稿日期］２００７－０８－０８

［作者简介］王鸿丽（１９７２－），女，本科，实验师［通讯作者］魏开华，（Ｅ－ｍａｉｌ）ｗｋｈ＠ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ．ｃｎ

陷胶的图谱作为范例进行分析，包括蛋白斑点过少，图谱中出现横、竖条纹，蛋白斑点扭曲等异常现象（图１）。

２

２．１

缺陷胶形成的原因及对策

蛋白斑点过少

蛋白斑点过少是较普遍的现象。样品未准确定量常导致上

样量过低，造成信息缺失（图１Ａ）；蛋白提取不完全（图１Ｂ）；没有（图１Ｃ）；样品浓度过高使得完全溶解的物质在胶上造成“污染”蛋白质溶解不充分，造成低表达蛋白在胶上不可见（图１Ｄ）；某些膜蛋白和纤维蛋白可溶于样品裂解液，但在等电聚焦过程中

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生物技术通讯

图１常见的缺陷胶图谱

Ａ：蛋白斑点较少；Ｂ：蛋白斑点大量丢失；Ｃ：斑点模糊；Ｄ：蛋白斑点少于实际斑点；Ｅ：大部分蛋白斑点堆积；Ｆ：碱性端蛋白大量堆积；Ｇ：部分蛋白斑点分离效果差；Ｈ：点横向拖尾（一）；Ｉ：点横向拖尾（二）；Ｊ：存在大量横条纹；Ｋ：小部分点有纵向拖尾；Ｌ：大部分点呈竖条纹状；Ｍ：出现空白条带；Ｎ：出现宽空

白条带；Ｏ：银染色不匀；Ｐ：有手印和脏乱条纹；Ｑ：扭曲的点（一）；Ｒ：扭曲的点（二）；Ｓ：扭曲的点（三）；Ｔ：低分子量蛋白流失；Ｕ：

蛋白点偏上

王鸿丽等：双向凝胶电泳缺陷胶及其原因

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全分开（图１Ｕ）。

２．３出现较多的水平条纹

过低浓度的去污剂、尿素、ＤＴＴ，低压运行时间过短等会导致

核酸横拖尾［６］（图１Ｈ）；蛋白上样量过大也会导致横拖尾（图１Ｉ）。会妨碍蛋白进入一向胶条并影响蛋白在胶内的迁移；另外，核酸和蛋白质可形成复合物，造成“假斑点”，在二向胶上产生条纹，可利用核酸内切酶去除核酸。选择偏碱性如ｐＨ６～１１的胶条，常会出现大量水平条纹（图１Ｊ），此时要求更长的聚焦时间；对于７

３结语

蛋白质双向电泳分离技术是多步骤、多试剂的实践性很强

的实验技术，受样品制备、浓度测定、上样方式、上样量、试剂配制、实验细节、染色方法等多个因素影响。样品制备是双向电泳成功的关键步骤，其具体方法依据研究目的不同而略有差异，需要考虑的因素包括：蛋白质的等电点范围、电荷数、相对分子质量；样品的溶解性和疏水性；蛋白质变性和还原；蛋白质相互作用去除；核酸及其他干扰分子去除；高丰度或不相关蛋白质去除等。要防止样品在聚焦时发生蛋白聚集、沉淀和样品制备过程中最大数量的蛋白发生提取后化学修饰，为了得到较好的分辨率、

分离距离和点、少的条纹和弱背景，应考虑到ｐＨ值梯度的宽窄、样品蛋白的复杂程度。实验细节是另外一个成功的关键，双向电泳操作人员在实验过程中要严格控制每一步骤，认真检查每一个试剂，这样才能获得高质量、高重复性的电泳图谱。

ｃｍ胶条，聚焦时间应增加６～１０倍；对于１８ｃｍ胶条，聚焦时间

增加５～７倍。采用杯式上样时，上样杯位置不正确也可导致该现象出现，建议将上样杯放在与要分离蛋白ｐＨ相反的位置。

２．４出现垂直条纹

上样量过大或某种蛋白的表达量太高会产生纵向拖尾（图

１Ｋ）；第二向电泳的电极缓冲液的ｐＨ值配制不正确或电极缓冲

液中ＳＤＳ过少（建议含量为０．１％）会引起胶上蛋白点拖尾（图

１Ｌ）；硝酸银染色时间过长，同时伴有凝胶背景底色过黑。２．５

出现空白垂直条纹

空白垂直条纹通常是指在胶面上看到的空白无蛋白斑点的垂直条纹，约４０％的凝胶有此现象，其原因为胶条和第二向凝胶之间有气泡（图１Ｍ）或空隙（图１Ｎ）。建议放胶条前将残留的水溶液用滤纸吸干净，并用琼脂糖溶液补充空隙。

参考文献

［１］

ＧｏｒｇＡ，ＷｅｉｓｓＷ，ＤｕｎｎＭ．Ｃｕｒｒｅｎｔｔｗｏ－ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅ－ｓｉｓｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｆｏｒｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ［Ｊ］．Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，２００４，４（１２）：３６６５－３６８５．［２］ＨｅｒｂｅｒｔＢＲ，ＭｏｌｂｙＭＰ，ｇｏｏｌｅｙＡＡ，ｅｔａｌ．Ｉｍｐｒｏｖｅｄｐｒｏｔｅｉｎｓｏｌ－

ｕｂｉｌｉｔｙｉｎｄｉｍｅｎｔｉｓｏｎａｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓｕｓｉｎｇｔｒｉｂｕｔｙｌｐｈｏｓｐｈｉｎｅａｓｒｅｄｕｃｉｎｇａｇｅｎｔ［Ｊ］．Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，１９９８，１９（５）：８４５－８５１．［３］

丁勤学，刘进，胡潇华，等．上样方式对蛋白质组双向电泳图谱质量的影响比较［Ｊ］．中国生物化学与分子生物学报，２００６，２２（３）：２３９－

２．６背景色不均匀

电极缓冲液存放过程中受到污染（图１Ｏ）；胶条进行二向转

移时，固定胶条的琼脂糖含有杂质或被污染；银染色时用手触摸胶体或重叠染胶，在凝胶上染出手印、划痕或背景显示杂乱等（图１Ｐ）；显色时甲醛浓度过低造成染色时间的延长，使凝胶背景变深显得杂乱。建议电极缓冲液存放于干净的容器内，重复使用不超过３次。

２．７蛋白斑点扭曲

第二向凝胶顶端不平造成一向胶条与二向胶接触不好，或

２４２．［４］

ＧｏｒｇＡ，ＷｅｉｓｓＷ．Ｔｗｏ－ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓｗｉｔｈｉｍｍｏｂｉ－ｌｉｚｅｄｐＨｇｒａｄｉｅｎｔｓ［Ｍ］∥ＲａｂｉｌｌｏｕｄＴ．Ｐｒｏｔｅｏｍｅｒｅｓｅａｒｃｈ：Ｔｗｏ－ｄｉ－ｍｅｎｓｉｏｎａｌｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｓ．ＮｅｗＹｏｒｋ：Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，２０００：６５－６８．［５］

ＷｉｌｄｇｒｕｂｅｒＲ，ＨａｒｄｅｒＡ，ＯｂｅｒｍａｉｅｒＣ．Ｔｏｗａｒｄｓｈｉｇｈｅｒｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ：ｔｗｏ－ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓｏｆＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｎｐｒｏ－ｔｅｉｎｓｕｓｉｎｇｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇｎａｒｒｏｗｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄｐＨｇｒａｄｉｅｎｔｓ［Ｊ］．Ｅｌｅｃ－ｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，２０００，２１（６）：１０９４－１１０３．［６］

陈主初，梁宋平．肿瘤蛋白质组学［Ｍ］．长沙：湖南科学技术出版社，

上胶条时为使胶条与胶面紧密接触而过于用力挤压胶条造成凝胶部分出现变形；局部凝胶聚合不完全或聚合过快（图１Ｑ）；聚合过程中凝胶液出现微漏（图１Ｒ）；胶与玻璃之间存有水分或气泡导致蛋白斑点扭曲（图１Ｓ）。

２．８其他

配制Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．８）缓冲液的实际ｐＨ值过高会导致电泳

时间过长，出现低分子量蛋白流失（图１Ｔ），造成实验结果信息的丢失；相反，则电泳时间过短，溴酚蓝已到达终点，而蛋白仍未完

２００２：８－１６．