红车轴草干细胞提取物【红车轴草提取物对胃癌ＢＧＣ－８２３细胞凋亡的影响】

　　摘　要：探讨红车轴草(Trifoliumpratense L)提取物对胃癌细胞株BCC-823的抑制增殖效应及诱导凋亡作用。我们采用不同浓度(50、100、250、500、1000mg／L)红车轴草提取物处理BCC-823细胞，采用四甲基偶氮唑盐(MTF)法检测药物对细胞的抑制作用，倒置显微镜观察细胞的形态学改变；AO／EB染色，荧光显微镜观察细胞凋亡形态；采用DNA Ladder观察DNA的降解；应用流式细胞仪观察细胞凋亡过程中的细胞周期的变化和细胞凋亡。结果显示在红车轴草提取物的作用下，BCC-823细胞呈凋亡改变，DNA琼脂糖凝胶电泳呈典型的凋亡特征。细胞凋亡的同时，细胞周期阻滞于C2／M期。实验结果表明红车轴草提取物能抑制胃癌BCC-823细胞增殖，能诱导胃癌细胞凋亡。
　　关键词：红车轴草提取物；胃癌细胞BCC-823；凋亡；增殖
　　中图分类号：R739．1
　　文献标识码：A
　　文章编号：1007-7847(2006)02-0178―05
　　红车轴草(Trifoliumpratense L)为豆科(Leguminosae)多年生草本植物，又名红三叶、红花苜蓿和三叶草等，属车轴草属(Trifolium L．)。国外民间用花序之煎剂祛痰、治感冒和肺结核、利尿和消炎，外敷治脓肿、烧伤和眼疾等，并曾有应用花、种子、植株及根部制膏、浸膏、糊剂、煎剂和泡茶饮用，作为治疗胃溃疡，抗胃癌、乳腺癌及肠癌等用途报道。文献载其主要功效为“镇痉、止咳止喘。全草制成软膏，治局部溃疡。对红车轴草提取物(Trifoliumpratense L.extract，TLE)直接的抗肿瘤作用的研究目前尚未见报道，本文研究红车轴草提取物体外对胃癌BGC-823细胞增殖和凋亡的影响，并进一步探讨其作用机制。
　　
　　1　材料和方法
　　
　　1．1 主要材料及仪器
　　人胃癌细胞系BGC-823由中南大学基础医学院病理学系赠送。红车轴草提取物(湖南九汇现代中药有限责任公司赠送)，溶解于二甲基亚砜(DMSO，Sigma)溶液中，浓度为2g／L，0．221xm滤器除菌后－20℃备存，临用前以RPMll640(Gibco)溶液稀释，实验时细胞悬液中DMSO的终浓度小于0．05％(V／V)。小牛血清为四季青生物工程公司产品。流式细胞仪(FCM)为美国Coulter公司生产；碘化丙啶(P1)为美国Sigma公司生产：酶联免疫检测仪为美国Bio-TEK(型号EL-312E)产品。
　　
　　1．2 红车轴草提取物的制备
　　用甲醇或乙醇提取红车轴草全草；过滤该提取液并浓缩；将浓缩液离心取渣；将药渣用石油醚或正己烷脱脂干燥；用乙酸乙酯萃取浓缩后，析晶得到提取物a；将萃取后渣用50％～90％的醇提取、回收醇，得浓缩液；将所得析晶后母液及浓缩液调pH值为8～10以内，过聚苯乙烯骨架大孔吸附树脂分离，得提取物b，将提取物a和b合并，用醇再精制，得高含量红车轴草提取物。
　　
　　1．3　实验方法
　　1．3．1 细胞培养
　　人胃癌细胞BGC-823培养于含有10％小牛血清，100U／mL青霉素、100U／mL链霉素RP-M11640培养基中，在37℃、5％CO2培养箱内常规传代培养。
　　1．3．2 MTT实验
　　药物组为0、50、100、250、500、1 000mg／L共6组，用培养液稀释，胃癌细胞以2×lO5／mL接种于96孔培养板，每孔加100μL培养液。每组设4个复孔，接种后24h更换培养液。实验组加入各浓度药物培养液，阴性对照不加药，空白对照加DMSO，加药后分别于24、48、72h加入20μLMTF，继续放人培养箱孵育4h后吸出培养液，加入120μLDMSO震荡溶解10min，空白对照调零，用酶联仪在波长490nm下检测各孔的吸光值。计算抑制率，抑制率＝[(阴性对照组OD值-实验组OD值)／阴性对照组OD值]X100％。
　　1．3．3 形态学观察
　　倒置显微镜下观察培养瓶内加药组和未加药组细胞形态变化情况。
　　1．3．4 荧光染色观察细胞凋亡形态
　　TLE(100mg／L)处理24h后，分别取对照组和实验组细胞悬液5μL于载玻片上，加5μL荧光染色液(AO+EB，100mg／L)染色2min，盖上盖玻片。在荧光显微镜下观察，根据细胞的颜色和核的结构观察凋亡细胞形态。
　　1．3．5 DNA Ladder测定
　　提取细胞中低分子质量的DNA进行DNA片段化分析。参照文献方法，用胰酶常规消化收集细胞，PBS洗3遍，按试剂盒步骤裂解细胞，加0．3 mLTBE缓冲液、0．25％NP-40及1％RNaseA，混匀，37℃保温30rain，再加入ProteinaseK(1g／L)，37℃继续保温30min，取上清液45μL加5laL上样缓冲液，在1．5％琼脂糖凝胶上电泳，EB染色，紫外灯下观察，摄影。
　　1．3．6 流式细胞仪分析红车轴草提取物对BGC-823细胞周期和细胞凋亡的影响
　　不同浓度(0、100、250、1000mg／L)的红车轴草提取物处理24h后，分别收集1×106个对照组和实验组细胞，PBS洗涤后用4℃预冷的70％乙醇固定，20mg／LRNaseA酶消化后，经50mg／L的碘化丙啶(P1)染色，流式细胞仪(FCM)检测凋亡细胞百分率及细胞周期改变，并用Modfith2．0软件分析。
　　
　　1．4 统计学处理
　　采用SPSSll．0统计学软件进行分析，以P50分别为332、140、19mg／L。
　　
　　
　　2．2 细胞形态学观察
　　倒置显微镜下观察可见，未经药物处理的肿瘤细胞呈梭形或不规则形，贴壁生长(图2-A)。经药物作用24h后，细胞先变圆、变小，折光性增强，许多细胞脱落成漂浮生长状态，出现凋亡小体的细胞，可见坏死细胞及其碎片，但仍然有少数贴壁细胞存在。随着药物浓度的增加及作用时间延 本文为全文原貌 未安装PDF浏览器用户请先下载安装 原版全文 长，凋亡细胞进一步增多。(图2-B)
　　
　　
　　2．3 荧光显微镜下观察细胞凋亡形态
　　对照组和实验组细胞经AO／EB染色后，在荧光显微镜下可见对照组细胞呈均匀绿色，细胞结构正常，表示对照组细胞为生长状况良好的活细胞(图3，A)；而经100mg／LTLE处理的实验组中出现体积缩小，核浓缩，呈浓集的橙色晚期凋亡细胞，伴有凋亡小体的出现；同时还出现弥散性浅红色的死亡细胞(图3-B)。此实验结果表明TLE能诱导BGC-823细胞发生凋亡。
　　
　　
　　2．4 DNALadder测定
　　不同浓度的TLE连续作用48h，经琼脂糖凝胶电泳分析，1000mg／L浓度组出现典型的DNA梯状条带(图4)。证实TLE能诱导细胞凋亡的发生。
　　
　　2．5 流式细胞仪测定结果
　　2．5．1 红车轴草提取物阻滞BGC-823细胞于G2／M期
　　不同浓度的TLE作用24h，BGC-823细胞的周期明显改变，G0／G1、S期细胞减少，G2／M期细胞增加．随着药物浓度增加，这种趋势越明显，与对照组比较，差异有显著性(P 本文为全文原貌 未安装PDF浏览器用户请先下载安装 原版全文