克伦特罗是检测_HPLC检测某些止咳中药制剂中的克伦特罗

　　摘要：建立ＨＰＬＣ法测定止咳中药制剂中非法掺入的化学止咳药物克伦特罗。选用Ａｇｉlｅｎｔ Ｃ１８（４．６ ｍｍ×１５０ ｍｍ，５ μｍ）柱，以甲醇∶０．０１ ｍｏl／Ｌ磷酸二氢钾溶液（磷酸调节ｐＨ值为３．５）＝２５∶７５（Ｖ／Ｖ）为流动相。根据所检测到化合物的色谱保留时间，并与对照品比较，鉴别中药制剂中非法掺入的克伦特罗。结果表明，试验建立的条件能够把中药制剂中添加的止咳化学药物（克伦特罗）完全分离出来；对２０种制剂用建立的分析技术进行了检测，经与相应的标准物质比较，得到２０种样品均未含克伦特罗。该方法选择性强，灵敏度高，可作为分析检测非法中药制剂的有效手段。
　　关键词：ＨＰＬＣ；止咳中药制剂；克伦特罗
　　中图分类号：Ｏ６５７．７＋２文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０11）11－2334-03
　　
　　Determination of Clenbuterol in Some Antitussive Traditional Chinese Medicines
　　by HPLC
　　
　　ＬＩＵ Ｚｈｉ－ｙｏｎｇ１，ＣＨＥＮＧ Ｑｉ－ｌａｉ２，ＬＩ Ｈｏｎｇ－ｌｉａｎｇ２
　　（１．Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｃｏｎｔｒｏｌ， Ｊｉ’ａｎ ３４３０００， Ｊｉａｎｇｘｉ， Ｃｈｉｎａ；
　　２． Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ， Ｇａｎｎａｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇａｎｚｈｏｕ ３４１０００， Ｊｉａｎｇｘｉ， Ｃｈｉｎａ）
　　
　　Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ａ ＨＰＬＣ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｌｅｎｂｕｔｅｒｏｌ ｍｉｘｅｄ ｉｌｌｅｇａｌｌｙ ｉｎ ｓｏｍｅ ａｎｔｉｔｕｓｓｉｖｅ Ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅｓ． Ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ Ｃｌｅｎｂｕｔｅｒｏｌ ｗａｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｂｙ ＨＰＬＣ ｏｎ Ａｇｉｌｅｎｔ Ｃ１８（４．６ ｍｍ×１５０ ｍｍ，５ μｍ）ｗｉｔｈ ｍｅｔｈａｎｏｌ－０．０１ｍｏｌ／Ｌ ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｄｉｈｙｄｒｏｇｅｎ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ （ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｃ ａｃｉｄ ａｄｊｕｓｔ ｐＨ ｔｏ ３．５）＝２５∶７５（Ｖ／Ｖ） ａｓ ａ ｍｏｂｉｌｅ ｐｈａｓｅ． Ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｃｏｍｐｏｕｎｄ ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ ｔｉｍｅ， ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｓｕｂｓｔａｎｃｅ， ｔｈｅ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｄｒｕｇ Ｃｌｅｎｂｕｔｅｒｏｌ ｍｉｘｅｄ ｉｌｌｅｇａｌｌｙ ｉｎｔｏ ＴＣＭ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ waｓ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ． Ｔｈｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｃｏｕｌｄ ｅｎｔｉｒｅｌｙ ｓｅｐａｒａｔｅ ｔｈｅ Ｃｌｅｎｂｕｔｅｒｏｌ ｆｒｏｍ ＴＣＭ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ． Ｕｓｉｎｇ ｔｈｉｓ ｍｅｔｈｏｄ， ２０ ｋｉｎｄｓ ｏｆ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ａｎｄ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ｓｔａｎｄａｒｄ ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ， Ｃｌｅｎｂｕｔｅｒｏｌ ｗａｓ ｕｎｄｅｔｅｃｔｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ２０ ｓａｍｐｌｅｓ． Ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ ｉｓ high ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ， ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ａｎｄ ｉｔ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｕｓｅｄ ａｓ ａｎ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｍｅａｎｓ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｉｌｌｅｇａｌ ＴＣＭ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ．
　　Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ＨＰＬＣ； antitussive ＴＣＭ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ； Ｃｌｅｎｂｕｔｅｒｏｌ
　　
　　我国药品市场上出现了在止咳中药制剂中添加克伦特罗、沙丁胺醇、氨溴索等化学药的现象［１］，面对此类违法行为，光凭肉眼很难识别，必须通过一定技术的检测才能进行，现有单一的薄层色谱法、紫外分光光度法，已很难满足检测的要求，尤其在干扰成分多且量少的情况［２-５］。虽然现有ＨＰＬＣ－ＭＳ法可以解决此类问题，但仪器太昂贵，基层单位很难拥有，故根据实际需要，建立了ＨＰＬＣ法这种专属性强、灵敏度高且基层适用的检测技术，有很大的实际应用意义。
　　１材料与方法
　　１．１试剂及样品
　　色谱纯甲醇（Ｆｉｓｈｅｒ，美国）、去离子水。克伦特罗对照品由中国药品生物制品检定所提供，批号：１０００７２－２００４０２。
　　共取２０种止咳中药制剂作为测试样品，分别编号为Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４、Ｓ５、Ｓ６、Ｓ７、Ｓ８、Ｓ９、Ｓ１０、Ｓ１１、Ｓ１２、Ｓ１３、Ｓ１４、Ｓ１５、 Ｓ１６、Ｓ１７、Ｓ１８、Ｓ１９、Ｓ２０，均为常用的市售止咳中药。
　　１．２仪器设备
　　Ａｎｇlｉｅｎｔ １２００型高效液相色谱仪（美国Ａｇｉｌｅｎｔ公司）。
　　１．３方法
　　１．３．１检测波长取克伦特罗对照品加甲醇制成１０ μｇ／ｍＬ的溶液。以甲醇为空白，置紫外可见分光光度计上，在４００～２００ ｎｍ的波长范围内进行扫描。选择克伦特罗的最大吸收波长。
　　１．３．２流动相及其组成分别试验了甲醇＋水、甲醇＋醋酸铵溶液、甲醇＋磷酸二氢钾溶液，经试验确定哪种流动相峰形效果最好。
　　１．３．３缓冲溶液酸碱度分别试验了ｐＨ值３．０、３．５、５．８的缓冲溶液对样品的保留及分离的影响。结果以杂质峰的保留时间明显减少、主峰峰形效果较好时为流动相的最佳ｐＨ值。
　　１．３．４对照品溶液的制备精密称取克伦特罗对照品10．80 ｍｇ，置２５０ ｍＬ容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀即得。
　　１．３．５供试品溶液制备若供试品为片剂、丸剂、颗粒剂，研细，称取一次最大服用剂量，置２５ ｍＬ容量瓶中，加甲醇２０ ｍＬ，超声处理１５ min，放冷，用甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液即得；若供试品为胶囊剂，取一次最大服用剂量内容物，研细，囊壳加水１０ ｍＬ加热使溶解，其溶液与胶囊内容物混合，置２５ ｍＬ容量瓶中，再加甲醇１０ ｍＬ，超声处理１５ min，放冷，用甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得；若供试品为口服液，精密量取１０ ｍＬ，用１ ｍｏl／Ｌ氢氧化钠调节ｐＨ值至１２，加入正丁醇－乙酸乙酯（１∶９）２０ｍＬ萃取两次，有机相蒸干，残渣滴加稀盐酸２滴，精密加甲醇至２５ ｍＬ溶解，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
　　１．３．６阴性对照溶液的制备取处方中不含克伦特罗的止咳平喘类中成药，按１．３．５的方法制备，即得。
　　１．３．７阳性对照溶液的制备精密称取克伦特罗对照品１ ｍｇ，加入处方中不含克伦特罗的止咳平喘类中成药中，混匀。按１．３．５的方法制备成阳性对照溶液。
　　２结果与分析
　　２．１ ＨＰＬＣ条件
　　色谱柱：Ａgilent Ｅｃlｉｐｓｅ ＸＤＢ－Ｃ１８（５ μｍ，４．６ ｍｍ×１５０ ｍｍ）；柱温：３０℃；流动相：甲醇∶０．０１ ｍｏl／Ｌ磷酸二氢钾溶液（磷酸调节ｐＨ值为３．５）＝２５∶７５（V/V）；流速：１．０ ｍＬ／ｍｉｎ；进样量：１０ μＬ；检测器：ＵＶ检测器；检测波长：２４３ ｎｍ。在此条件下，各对照品色谱图如图１。
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　　精密称取克伦特罗对照品１０．８0 ｍｇ，置２５ ｍＬ容量瓶中，加甲醇定容至刻度。精密量取上述对照品溶液１．０、２．０、３．０、４．０、５．０ ｍＬ，置于１０ ｍＬ容量瓶中，加甲醇分别配制克伦特罗浓度为４３．２、８６．4、１２９．６、１７２．８、２１６．０ μｇ／ｍＬ的一系列溶液，以对照品浓度为横坐标x，峰面积积分值为纵坐标y，绘制标准曲线，得线性回归方程和相关系数为，＝
　　１７．０８０ ４５x－２７．８５２ ２，ｒ＝０．９９９ 6，试验结果表明克伦特罗在４３．２～２１６．０ μｇ／ｍＬ之间线性关系良好。
　　２．３检出限试验
　　取１．３．４项下对照品溶液（４３．２ μｇ／ｍＬ）稀释若干倍，精密吸取对照品溶液１０ μＬ，注入液相色谱仪，记录主峰高约为噪音峰高３倍时的色谱图，测得克伦特罗的检出限为０．８６４ μｇ／ｍＬ（图２）。
　　２．４精密度试验
　　取１．３．４中对照品溶液，按色谱条件下方法，以１０ μＬ的进样量分别注入色谱仪５次，记录色谱图，按克伦特罗峰面积计算，变异系数为１．２％（ｎ＝５），表明精密度良好。
　　２．５回收率试验
　　精密称取克伦特罗对照品１．２０ ｍｇ，照１．３．４项制备成对照品溶液。取１．１项下样品Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３的一次最大服用量各３份，精密称取克伦特罗对照品适量分别加入到上述样品中，照１．３．５项下方法制备成供试品溶液，按色谱条件下方法进行回收率试验，计算其平均回收率为８５．４％（表１）。
　　２．６重复性试验
　　取１．３．５下供试品溶液各进样５次，依法操作，变异系数为１．１％（ｎ＝５），表明该方法重复性良好。
　　２．７样品测定
　　精密称取克伦特罗对照品１２．３１ ｍｇ，照１．３．４项下方法制备成对照品溶液，取１．１项下样品Ｓ１～Ｓ２０，照１．３．５项下方法制备成供试品溶液，分别精密吸取供试品溶液与对照品溶液各１０ μＬ，注入液相色谱仪，记录色谱图。供试品色谱中，未呈现与对照品保留时间一致的色谱峰，检测结果见表２。
　　３小结
　　１）由于液体制剂杂质峰干扰较多，因此液体制剂提取过程中先用混合溶剂萃取，除去部分杂质，再用甲醇提取。
　　２）以精密度试验中系统适应性试验的平均值为依据，理论板数按克伦特罗峰计算应不低于２ ５００。
　　３）由于处方中药味较多，互相干扰较严重，相邻峰与克伦特罗峰不易分离，曾试验了甲醇－水、甲醇－醋酸铵溶液、乙腈－水等流动相，经大量试验证明，甲醇＋０．０１ ｍｏl／Ｌ磷酸二氢钾溶液峰形分离效果较理想。
　　参考文献：
　　［１］ 王猛，孙忠亲，宫瑞萍．ＨＰＬＣ测定喘舒片中盐酸克仑特罗含量［Ｊ］．中成药，２００３，２５（４）：３４３－３４４．
　　［２］ 董宇，孔璋，钟大放．液相色谱－质谱联用法检测中药降糖制剂中非法掺入的苯乙双胍和格列本脲［Ｊ］．沈阳药科大学学报，２００５，２２（１）：１９－２０．
　　［３］ 孙玉明，孙苓苓，钟大放．液相－质谱联用法检测某些中药制剂中的格列本脲［Ｊ］．药物分析杂志，２００５，２５（３）：３２６－３２８．
　　［４］ 吴美香，黄丽彬．ＴＬＣ结合ＨＰＬＣ法检测保健食品及中成药中掺加化学降糖药物的研究［Ｊ］．医药管理，２００７，１４（３）：１４８－１４９．
　　［５］ 钟丽红，凌霄，孙华． ＨＰＬＣ／ＭＳ２法检测某些降糖中药制剂中的双胍类及磺酰脲类化学药［Ｊ］．药物分析杂志，２００８，２８（１０）：１６８３－１６８５．
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