[质谱分析在SNPs方面的应用及前景展望]质谱发展未来前景

　　中图分类号：O657.6 文献标识码：A　　摘要：近年来，质谱分析作为一种先进的分析方法，在多种学科多种领域起着及其的作用，本文介绍的是它在SNPs方面的应用。
　　关键词：质谱分析；SNPs；前景
　　质谱法产生于20世纪初，开始仅用于测定元素的原子质量、同位素丰度。50年代后，开始应用于有机化合物结构分析研究。质谱分析法与其他分析方法相比具有两个突出的优点：
　　（1） 它是至今唯一可以确定物质分子质量的方法，在高分辨质谱仪中不仅能够准确测定分子质量，而且可以确定化合物的化学式和进行结构分析。
　　（2） 质谱法的灵敏度高。
　　近几年来质谱仪器发展很快，它能广泛应用于原子能、石油华工、环境保护、医药卫生、商品检验等领域。
　　下面我们开始研究一下，质谱分析在SNPs方面的应用。
　　SNPs即单核苷酸的多组台。地球上的大部分物质各自都具有稳定的基因序列，但对于一个物种群体中的每一个个体，在其DNA序列上的某些特定的位置会出现不同的碱基。在不同个体的同一条染色体或者同一位点的核苷酸序列汇总，绝大多数核苷酸序列一致。而只有一个碱基不同的现象，生物学家称为单核苷酸的多态现象（Single Nucleotide Polymorphism，SNP）。SNPs是人列基因组DNA序列中最常见的变异形式，它存在于任意选定的任意两个DNA的核苷酸个体。由于基因组DNA序列的变异，被大多数的科学家所认同，他们认为SNPs在疾病的易患病体制和抗药性和药物过敏体制，个体之间的差异起着重要的作用。
　　我们通常所用的SNPs质谱分析的操作流程包括7个步骤。如下：
　　（1） 人类基因组DNA的制备
　　（2） PCR
　　（3） PCR产物的纯化
　　（4） 等位基因特异性引物延伸反应
　　（5） 等位基因特异性引物延伸反应的钝化
　　（6） MS样品的制备
　　（7） 自动检测、数据采集及等危机因分析
　　SNPs的质谱分析主要包括4个方面的工作，即标准化的分子生物学反应，在mapII/pure智能工作站进行的全自动样品纯化、全自动样品上样及等危机因特异性片段的MALDI—TOF质谱仪检测。
　　在实际应用中，第一步，在96孔PCR板中按照标准条件进行基因组DNA的PCR扩增，为了避免交叉污染，可讲PCR反应分别用于手工操作，将反应液分别加于各孔中。扩散反应结束后，将反应液移入智能平台，按操作规程自动除去DNA中残余的核苷酸、引物、酶和盐，即进行PCR产物可作摸板，直接用于等位基因特异性引物延伸反应，次反应由智能工作站自动进行。引物延伸反应是，将微孔手动移入热循环仪，延伸反应结束后再置于只能平台上，采用genopure oligo磁珠，DNA纯化系统自动钝化等为基因特性引物。
　　SNPs的质谱分析方法特点
　　应用MALDI-TOF质谱进行SNPs分析是基于根据不同的分子量可以将等位基因排序。如产物中存在两个单核苷酸多态性位点，每一个位点有一个等位基因，那么该等位基因是纯合子。如果两个单核苷酸多态性都是杂合子，那么质谱仪将会捕捉到四个不同的波谱峰。不同的波谱峰形状代表电荷标记的不同质量。在多重分析中如果两个不同的SNP位点的任意两个等位基因质量相同时，电荷标记给出绝对质量信息，根据这些信息就可以自动化等位基因分析。分析DNA，进行等位基因聚类分析，既有快捷、所需样本量极少的特点，并且可以给出绝对质量信息，根据这些信息就可以自动化等位基因分析。
　　虽然人类基因组SNPs数量众多,但是染色体上相邻SNPs的等位位点倾向于以一个整体遗传给后代,这些位于染色体上某一区域的一组相关联的SNP等位位点被称作单体型（haplotype）。大多数染色体区域只有少数几个常见的单体型（每个具有至少5%的频率）,它们代表了一个群体中的大部分多态性。一个染色体区域可以有很多SNP位点,但是少数几个标签SNPs（TagSNPs）就能够提供该区域内大多数的遗传多态模式。人类基因组单体型计划通过对约100万个SNPs进行基因分型,拟构建人类DNA序列中多态位点的常见模式。人类基因组单体型图谱的逐渐绘制完成,提供了详尽的人类DNA序列的变异信息,对人类个体遗传背景的研究提供了强大的机遇和挑战。
　　随着SNPs检测技术的进展,SNPs在人群中的检测日益得到广泛应用,特别是对于当前多基因复杂疾病如肿瘤、冠心病的遗传易感性的探讨,传统的以家系为基础的连锁分析在检测能力上已经有了明显的局限性,而病例-对照等易于开展的关联性研究方法有显著的优势。因此,近几年探讨SNPs作为复杂性疾病的遗传标记的关联性研究大量涌现。预计引起细胞功能学改变的SNPs在人类所有SNPs中只占极小一部分（约五万到二十五万个SNPs）,大多仅仅在疾病发生过程中介导低度或中度的效果,主要包括分布在基因启动子区域可能发挥调节转录效应的SNPs（regular SNPs, rSNPs）和蛋白质编码区域引起编码氨基酸改变的SNPs（非同义SNPs或错义SNPs）。当前分子生物学技术的进展推动了SNPs功能学研究的深入,如比较成熟的对于启动子区域SNPs功能学研究技术包括：
　　① 报告基因转染技术,这一技术主要用于研究启动子SNPs对于mRNA转录效率的影响, 通过观察转录结局来判断SNPs是否具有功能。
　　② 凝胶迁移滞后实验(electrophoretic mobility shift assays, EMSA),该技术通过在体外合成含SNPs位点的寡核苷酸与转录因子特异性结合,观察二者结合的强度和效率,但是该技术由于只是人工合成较短长度的寡核苷酸,没有考虑SNPs位点周围遗传背景环境的影响。
　　③ 染色质免疫沉淀分析（chromatin immunoprecipitation assay, ChiP）,该技术通过超声将染色体碎片化,再将碎片化的核酸片段与转录因子结合, 然后通过PCR技术扩增观察判断二者结合的效率和强度。当然,对于关联研究的结果的评价和验证需要综合SNPs所在序列信息、进化保守性的有无、人群遗传学、实验室功能学证据、暴露评价（如基因型-环境交互作用研究）和流行病学证据,如Rebbeck等根据上述综合证据把SNPs是否具有功能效应分为强支持功能显著性、中度。
　　综上，今天，药物遗传学和临床药理学的发展需要多学科的交叉合作，除了人类基因组的DNA序列资料外尚需要药理学、毒理学、生物信息学和基因组学的参与。但这些的基础是在质谱分析的发展上所发展起来的。所以如果我们今天致力于SNPs分析方法的研究会使明天的学术发生翻天覆地的变化。而这些则是以质谱分析在SNPs方面的研究的成果为前提的。
　　参考文献：
　　[1]马庆伟 程肖蕊 ? 时间：2007-09-12 13:30:26《生物技术世界》
　　分析化学（下）第三版