[花生DＮA三种不同限制酶切组合的AFLP多态性标记分析]DNA聚合酶

　　摘要：利用扩增片段长度多态性（Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｌｅｎｇｔｈ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ，ＡＦＬＰ）标记技术，３种不同的酶切组合，其中ＥｃｏＲⅠ／ＭｓｅⅠ２４０对引物、ＰｓｔⅠ／ＭｓｅⅠ９６对引物、ＰｓｔⅠ／ＴａｑⅠ９６对引物，对汕油１６２×Ｓｕｎｏｌｉｅｃ９５Ｒ作图亲本进行分析，统计了不同酶切组合的扩增总带数、多态性位点及多态性率。多态性位点、多态性率及扩增总带数都有不同程度的差异，说明尝试不同的限制酶组合可以揭示出花生品系间更为丰富的遗传变异。有望开发ＡＦＬＰ分子标记，为花生分子育种打下基础。
　　关键词：花生；ＡＦＬＰ；多态性；内切酶
　　中图分类号：Ｓ５６５．２文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０11）12－2555-03
　　
　　Ｔｈｅ ＡＦＬＰ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｐｅａｎｕｔ ｏｆ Ｔｈｒｅｅ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ Ｅｎｚｙｍｅ Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ
　　
　　ＤＩＮＧ Ｊｉｎ－ｐｉｎｇ
　　（Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｐｌａｎｔ－Ｍｉｃｒｏｂｅ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ，Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓｈａｎｇｑｉｕ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈａｎｇｑｉｕ４７６０００，Ｃｈｉｎａ）
　　
　　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｏｔａｌｌｙ ２４０ ＥｃｏＲⅠ／ＭｓｅⅠＡＦＬＰ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｐｒｉｍｅｒ ｐａｉｒｓ， ９６ PｓｔⅠ／ ＭｓｅⅠＡＦＬＰ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｐｒｉｍｅｒ ｐａｉｒｓ ａｎｄ ９６ PｓｔⅠ／ ＴａｑⅠＡＦＬＰ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｐｒｉｍｅｒ ｐａｉｒｓ ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｈａｎｙｏｕ１６２×Ｓｕｎｏｌｉｅｃ９５Ｒ ｐｅａｎｕｔ ｍａｐｐｉｎｇ ｐａｒｅｎｔａｌ ｌｉｎｅｓ， Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｉｎ ｔｏｔａｌ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｂａｎｄｓ， ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ ｂａｎｄｓ ａｎｄ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ． Ｔｈｅ ｓｔｕｄｙ ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄ ｔｈａｔ ｒｅｓｏｒｔｉｎｇ ｔｏ ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｅｎｚｙｍｅ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ ｍａｙ ｂｅ ｄｉｓｃｌｏｓｅｄ ｉｎ ｇｅｎｅｔｉｃ ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｃｕｌｔｉｖａｔｅｄ ｐｅａｎｕｔ． Ｉｔ ｉｓ ｊｕｄｉｃｉｏｕｓ ｏｐｔｉｏｎｓ ｉｎ ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ ＡＦＬＰ ｍａｒｋｅｒｓ ｓｏ ｔｈａｔ ｔｏ ｌａｙ ｔｈｅ ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｒｅｅｄｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｐｅａｎｕｔ．
　　Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｐｅａｎｕｔ；ＡＦＬＰ；ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ；ｅｎｄｏｎｕｌｅａｓｅ
　　
　　花生（Ａｒａｃｈｉｓ ｈｙｐｏｇａｅａ，２ｎ＝４ｘ＝４０）是我国重要的油料作物和经济作物，优良品种花生仁粗脂肪含量在５０％左右，其中油酸和亚油酸之和占总脂肪酸的８０％。油酸和亚油酸分别含有一个和两个不饱和键十八碳烯酸，二者之比――油酸亚油酸比值（Ｏ／Ｌ值）是影响花生及其制品耐储藏性的重要指标。一般花生品种油酸含量为３７％～６７％［１］。花生是一种普通农作物，但其在ＤＮＡ分子水平上却表现出与其他作物不同的特性。尽管不同类型间和同一类型不同品种间的花生，在农艺性状如生长开花习性、抗逆性、品质特性等方面存在着广泛的遗传变异，但早期用随机扩增多态性ＤＮＡ（Ｒａｎｄｏｍ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ ＤＮＡ，ＲＡＰＤ）和限制性内切酶片段长度多态性（Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｌｅｎｇｔｈ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ，ＲＦＬＰ）等分子鉴定技术检测到栽培花生ＤＮＡ几乎没有或只有很低的多态性［２－４］。基于花生基因组ＤＮＡ的特殊性和相关基础分子遗传学研究的不足，目前尚未建立栽培花生的遗传连锁图，与其他主要农作物相比，花生分子标记研究尚处于起步阶段。目前在花生上可用的微卫星ＳＳＲ（Ｓｉｍｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅｐｅａｔｓ）标记数量仍然很有限，而且不是所有的基因或农艺性状都可以用ＳＳＲ进行标记，因此，在花生上还需要分离更多其他类型的标记。ＡＦＬＰ由于无需预先知道目标生物的序列信息并且一次可同时检测多个位点，ＡＦＬＰ和分离群体分组分析（Ｂｕｌｋｅｄ ｓｅｇｒｅｇａｎｔ ａｎａｌｙｓｉｓ，ＢＳＡ）方法相结合被认为是挖掘紧密的分子标记和构建目标基因区饱和连锁图最为有效的方法之一［５－７］。研究利用ＡＦＬＰ标记技术，选用不同的酶切组合寻找亲本的差异，为以后利用ＡＦＬＰ和ＢＳＡ相结合的方法寻找与Ｏ／Ｌ值性状连锁的ＡＦＬＰ标记奠定了基础，也为花生分子辅助育种奠定了基础。
　　１材料与方法
　　１．１材料
　　花生汕油１６２（由广东省汕头市农业科学研究所育成），其Ｏ／Ｌ值为１．１２；花生Ｓｕｎｏｌｉｅｃ９５Ｒ（Ｆ１２５０）是美国弗罗里达大学于１９９７年注册的高油酸新品种，其油酸含量高达８０．６％，而亚油酸含量仅为２．８％，Ｏ／Ｌ值高达２８．７９。
　　１．２ＤＮＡ的提取
　　取花生幼苗的幼嫩叶子，按唐荣华［８］方法稍加改进进行。
　　１．３ＡＦＬＰ分析
　　ＡＦＬＰ分析流程参考文献［８］，３对内切酶组合分别合成２４０、９６、９６对引物（表１），采用６％聚丙烯酰胺凝胶分离分析，常规银染法染色，按照清晰可辨的原则统计扩增条带。
　　２结果与分析
　　图１为３种限制性酶组合部分ＡＦＬＰ扩增图谱。应用３种不同的酶切组合合成的引物对，对亲本Ｓｕｎｏｌｉｅｃ９５Ｒ和汕油１６２ ＤＮＡ进行扩增，不同的酶切组合扩增的结果不同。
　　ＥｃｏＲⅠ／ＭｓｅⅠ共２４０对引物，每对引物扩增出条带数为１２～８８，总共扩增出的条带数为１１ ６４０条，其中９０对引物在两个亲本间可以扩增出多态性，每对ＡＦＬＰ引物在两个亲本间扩增出的多态性位点为１～３个，共１７４个多态性位点，多态性率为１．４９％。
　　ＰｓｔⅠ／ＭｓｅⅠ共９６对引物，每对引物扩增出条带数为１２～６１，总共扩增出的条带数为３ ２１０条，其中３４对引物在两个亲本间可以扩增出多态性，每对ＡＦＬＰ引物在两个亲本间扩增出的多态性位点为１～６个，共７６个多态性位点，多态性率为２．３７％。
　　ＰｓｔⅠ／ＴａｑⅠ共９６对引物，每对引物扩增出条带数为１０～５６，总共扩增出的条带数为２ ５３０条，其中２８对引物在两个亲本间可以扩增出多态性，每对ＡＦＬＰ引物在两个亲本间扩增出的多态性位点为１～８个，共６１个多态性位点，多态性率为２．４１％。
　　３讨论
　　通过试验获得了能揭示作图亲本间遗传差异的不同引物对，不同的酶切组合多态性位点不同，多态性率也有差异，为今后构建图谱打下了基础，为今后分子标记的开发提供了一些参考依据。２００４年Ｈｅｒｓｅｌｍａｎ［９］在定位与花生抗蚜性相关的ＡＦＬＰ
　　标记时曾采用过不同的酶切组合，检出不同组合间多态性率存在显著的差异；２００５年徐建芝［１０］研究了两种酶切组合在亲本和Ｆ１代之间多态性比率，发现不同酶切组合间也存在极显著差异。本文利用ＡＦＬＰ方法在研究花生Ｏ／Ｌ值时，发现不同的限制性酶组合，其亲本间多态性位点数，多态性率也存在差异。说明ＡＦＬＰ分析时，尝试不同的限制性酶可显著提高ＡＦＬＰ分析的辨别力。至于在花生栽培研究中，更优的限制性酶切组合还需要根据不同的研究目的，采用更多的材料进一步验证。
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