制备单克隆抗体两次筛选 解读单克隆抗体制备过程中的两次筛选及考查例解

　　一、原理阐释　　“单克隆抗体的制备”是选修三“动物细胞工程”这一章的重点内容，虽然高考对选修教材要求层次相对较低，但两次筛选过程仍时有考查。课本中对第一次筛选这样叙述：“根据这个设想，他们首先将抗原注射入小鼠体内，然后从小鼠脾脏中获得能产生抗体的B淋巴细胞，与小鼠骨髓瘤细胞在灭活的仙台病毒或聚乙二醇的诱导下融合，再在特定的选择性培养基中，筛选出杂交瘤细胞。”学生在预习中多次会问及这是什么样的选择培养基，怎样选择。在诱导剂作用下，培养基中会出现三种细胞，B淋巴细胞与B淋巴细胞融合，骨髓瘤细胞与骨髓瘤细胞融合，以及B淋巴细胞与骨髓瘤细胞的融合，未融合的B淋巴细胞、未融合的瘤细胞，以及细胞的多聚体形式等。正常的B淋巴细胞在培养基中存活仅5～7天，不需特别筛选，细胞的多聚体形式也容易死去，而未融合瘤细胞则需进行特别的筛选去除。
　　在普通动物培养基中加入次黄嘌呤、氨基蝶呤、胸腺密啶脱氧核苷酸制成HAT培养基，这是根据细胞中的DNA合成途径有两条：一条途径是生物合成途径（“D途径”），即由氨基酸及其他小分子化合物合成核苷酸，为DNA分子合成提供原料。此过程中，叶酸作为重要辅酶参与此过程，而HAT培养液中氨基蝶呤是叶酸的拮抗物，可以阻断DNA合成的“D途径”，氨基蝶呤这种独特的拮抗叶酸作用，也广泛用于医学领域，如治疗一些顽固性疾病、类风湿性关节炎、牛皮癣等，效果显著。DNA的另一条合成途径是应急途径（“S途径”），它是利用次黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核苷酸转移酶和胸腺嘧啶核苷激酶，催化次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷生成相应的核苷酸，两种酶缺一不可。因此，在HAT培养液中，未融合的效应B细胞和两个融合的效应B细胞融合的“D途径”被氨基蝶呤阻断，虽“S途径”正常，但因缺乏体外培养液中增殖的能力，一般10d左右死亡。对于骨髓瘤细胞及自身融合细胞而言，由于通常采用的骨髓瘤细胞是次黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核苷酸转移酶缺陷型细胞，因此，自身无“S途径”，且“D途径”又被氨基蝶呤阻断，所以HAT培养液中也不能增殖而很快死亡。只有瘤细胞与效应B细胞相互融合的细胞，既有效应B细胞的“S途径”，又具有骨髓瘤细胞在体外培养液中长期增殖的特性，因此能在HAT培养液中选择性存活下来，并不断增殖。
　　课本中对第二次筛选是这样叙述的：“他们培养杂交瘤细胞，从中选出能够产生所需抗体的细胞群，继续培养，以获得足够数量的细胞，在体外条件下，做大规模培养或注射到小鼠腹腔内增殖。”其中“从中选出能够产生所需抗体的细胞群”这句话较为概括，学生会产生疑问：“已经是效应B细胞和瘤细胞的融合体，为什么还要筛选？难道产生的抗体还有区别吗？”
　　在单克隆抗体制备过程中，由于注射的抗原（病毒、细菌或抗原蛋白）具有多种抗原决定簇，而一种决定簇刺激机体产生一种效应B细胞，进而产生一种针对决定簇的抗体，所以经HAT培养液第一次筛选出的杂交瘤细胞产生的抗体存在差异，必须对杂交瘤细胞群进行第二次筛选，选出能产生特定抗体的杂交瘤。二次筛选通常采用有限稀释克隆细胞的方法，将杂交瘤细胞多倍稀释，接种在多孔细胞培养板上，使每孔细胞不超过一个，通过培养让其增殖，然后检测各孔上清液中细胞分泌的抗体，上清液可与特定抗原结合的培养孔为阳性孔。阳性孔中的细胞还不能保证是来自单个细胞，继续进行有限稀释，一般重复3～4次，直至确保每个孔中增殖的细胞为单细胞。同时，再由这些单细胞克隆生长，最终选出分泌预定特异抗体的杂交细胞株进行扩大培养，第二次筛选也是鉴定过程，因此，单克隆抗体制备过程中，两次筛选的原理和方法是不同的。
　　二、习题举例
　　例：人绒毛膜促性腺激素（HCG）是女性怀孕后胎盘滋养层细胞分泌的一种糖蛋白，制备抗HCG单克隆抗体可用于早孕的诊断。下图是抗HCG单克隆抗体制备流程示意图，请分析回答：
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　　（1）制备单克隆抗体过程中要用到（动物细胞培养）和（动物细胞融合）技术。
　　（2）制备单克隆抗体过程中，给小鼠注射的HCG相当于（抗原），使小鼠产生分泌相应（抗体）的淋巴细胞，此过程属于特异性免疫中的（体液）免疫。
　　（3）在细胞内DNA合成一般有两条途径，主途径是在细胞内由糖和氨基酸合成核苷酸，进而合成DNA，而氨基喋呤可以阻断此途径。另一辅助途径是在次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷存在的情况下，经酶催化作用合成DNA，而骨髓瘤细胞的DNA合成没有此辅助途径。
　　①利用DNA合成途径不同的特点配制的HAT培养基含有多种成分，其中添加的（氨基喋呤）成分具有筛选杂交瘤细胞的作用。
　　②最终筛选获得的杂交瘤细胞的特点是（能无限增殖并分泌特异性抗体）。
　　（4）此过程生产的单克隆抗体可以与（人绒毛膜促性腺激素/“HCG”）特异性结合，从而诊断早孕。