[生物光的真谛：绿色荧光蛋白] 绿色荧光蛋白激发光

　　荧光蛋白发出的生物光，照亮了生命体的活细胞，使科学家获得21世纪的“神眼”。三位美国科学家下村修、马丁・沙尔菲和钱永健发现并发展了绿色荧光蛋白而获得了2008年诺贝尔化学奖。
　　下村修1928年出生于日本东京都府，1960年获得名古屋大学有机化学博士学位后赴美，先后在普林斯顿大学、波士顿大学和伍兹霍尔海洋生物实验室(MBL)工作。现为MBL和波士顿大学医学院名誉教授。他最先发现了荧光蛋白，成为生物发光研究的第一人，从而获得了2008年化学奖。
　　沙尔菲1947出生于美国芝加哥，1977年获得哈佛大学神经生物学博士学位，1982年任美国哥伦比亚大学生物学教授。他探明绿色荧光蛋白发光的遗传标签作用，从而荣获了2008年化学奖。
　　钱永键1952年出生于纽约，在新泽西州利文斯顿长大。他是一位科学天才：16岁中学时代便获得了美国全国性西屋天才奖第一名；后又获全美优秀学者奖而获美国国家优等生奖学会而进入哈佛大学；20岁时便获化学和物理学博士学位从母校毕业。钱永健的家庭堪称科学之家：他的堂伯钱学森是我国顶尖的科学家。他父亲是机械工程师；母亲的几位兄弟都是麻省理工学院的工程学教授；他的哥哥钱永佑是神经生物学家，曾任斯坦福大学生理系主任。永健和永佑分别获得美国大学生竞争性最强的两个奖学金Rbodes和Marshall学者奖，后到英国留学：90年代双双成为美国科学院院士。钱永健现为美国加州大学圣迭戈分校生物化学及理学教授，是霍华德休斯医学研究所的研究员，为美国国家科学院及医学院两院院士。他于2004年荣获被称为诺贝尔奖前奏的沃尔夫医学奖。他成功地利用绿色荧光蛋白来追踪并查实生命体内的生物化学反应而荣膺2008年化学奖，成为GFP工程领域的公认先驱。
　　
　　下村修发现绿色荥光蛋白
　　
　　早在20世纪50年代开始，人们已开始发现化学世界的发光体。1955年美国人达文波特发现一些水母可以发出绿光，之后俄罗斯人卢科雅诺夫从珊瑚里发现了红色荧光蛋白，但他们都不知道这种生物光产生的原因。这种神秘现象给下村修以启迪：生命体内确存在自身能发光的蛋白质，而无需底物。于是他选定了这个课题进行研究。
　　1962年，下村修和助手约翰森在从一种随北美西海岸洋流漂移的维多利亚多管水母体内提取生物发光蛋白一水母素时，意外地发现一种能在紫外光下发下发出强烈绿色的蛋白，便名命为绿色蛋白(GP)。同年他们详细研究了这种蛋白的发光特性，发现其在阳光下呈绿色、钨丝下呈黄色、紫外光下发出强烈绿色。于是，他们在美国《细胞和比较生理学杂志》上报道：分离纯化了水母中发光蛋白水母素。1963年，下村修及其助手探明水母素发光的原理：水母素在钙的刺激下其能量可以转移到绿色蛋白，从而刺激绿色蛋白发光。他们在《科学》杂志报道了新的研究成果：钙和水母素发光的关系。
　　1974年，丁村修纯化这种绿色蛋白，并正式命名为绿色荧光蛋白(GFP)。他们研究发现：GFP在水母中之所以能发光，是因为水母素和GFP之间发生了能量转移；水母素在钙的刺激下发光，其能量可转移到GFP，刺激GFP发光。这是物理化学中荧光共振能量转移(FRET)在生物中的发现。
　　
　　沙尔菲找到了GFP的遗传标记　
　　马丁・沙尔菲研究紧接着下村修进行研究后指明：水母素和GFP都可以发出生物光，在作为21世纪生物跟踪显影技术中有重要的应用。他的研究发现水母素乃是荧光酶的一种，它需要荧光素才能发光；而GFP蛋白质本身就可以发光，而这就意味着，GFP可以很方便地被植入生物体，作为一种标记物，跟踪和制断生物细胞的变化找到了GFP作为多种生物学现象的发光遗传标记，从而确认了这种有无限应用价值的生物光遗传基因。
　　沙尔菲采用分子生物技术以秀丽隐杆线虫为实验模型进行研究发现，GFP使这种线虫的6个单独细胞呈现了颜色。1992年，沙尔菲分离到水母发光蛋白的配对物GFP，并发现作为辅助蛋白的GFP在水母中的功能是将其所产生的蓝光转换为绿光。这是因此它们之间进行能量转换的缘故。原来体内含有一种生物发光蛋白质aequorin，本身发蓝光。GFP能把这种光转变成绿光，也就是当水母容光焕发的时候我们实际看到的颜色。GFP的纯溶液在典型的室光下呈黄色，但是当被拿到户外的阳光下时，它会发出鲜绿的颜色。这种蛋白质从阳光中吸收紫外光，然后以能量较低的绿光形式发射出来。
　　他采用聚合酶链反应(PCR)，发现水母GFP是由238个氨基酸组成的单体蛋白质，分子量约27kD，GFP荧光的产生主要归功于分子内第65、66、67位丝氨酸、酪氨酸、甘氨酸形成生色团的功效。翻译出的蛋白质折叠环化之后，在02存在下，分子内第67位甘氨酸的胺对第65位丝氨酸的羧基的亲核攻击形成第5位碳原子咪唑基，第66位酪氨酸的α2 β键脱氢反应之后，导致芳香团完成。GFP晶体结构显示，蛋白质中央是一个桶状结构，长420nm，宽240nm，由11个围绕中心α螺旋的反平行B折叠组成，荧光基团的形成就是从这个螺旋开始的，桶的顶部由3个短的垂直片段覆盖，底部由一个短的垂直覆盖，对荧光活性很重要的生色团则位于大空腔内。实验表明GFP荧光产生的前提是桶状结构完整性，去除N端6个氨基酸或C端9个氨基酸，GFP均会失去荧光。这是由于生色团形成的效率较低，而且形成过程受外界环境影响较大的缘故。
　　GFP是一种现成的荧光蛋白质，因此它特别容易使用。大多数可以处理光的蛋白质都利用外来的分子吸收和释放光子。例如，我们眼睛里的视紫红质利用维生素来感光。这些“发光团”必须是专门为了发光而生成的，并且被仔细地插入到该蛋白质分子内，不同的是，GFP控制光的部位是其自身的一部分，仅由氨基酸构建而成，该部位含有一段三个氨基酸组成的特殊序列：丝氨酸一酪氨酸一甘氨酸。当蛋白质链折叠时，这段短片就被深埋在蛋白质内部，然后发生一系列化学反应：甘氨酸与丝氨酸之间形成化学键，生成一个新的闭合环，随后这个环会自动脱水。最终，经过大约一个小时的反应，周围环境中的氧气攻击酪氨酸的一个化学键，形成一个新的双键并合成荧光发色团。由于GFP可以形成自己的发色团，它非常适合于基因工程，根本不必担心操作任何奇怪的发色团，只需要利用遗传学的方法操纵细胞合成GFP蛋白质，GFP就会自动折叠并开始发光。
　　GFP遗传标记的发现在科学研究上有着惊人的用途，因为它能够使我们直接看到细胞内部生命分子 的运动情况。它使我们在任何指定的时间都可以轻易地找出GFP在哪儿只需要用紫外光去照射，这时所有的GFP都将发出鲜艳的绿色。你可以把GFP连接到一种病毒上。然后，随着病毒在宿主体内不断扩散，就可通过跟踪发出的绿光来观察病毒的扩散途径；或者你把它接合到一种蛋白质上并通过显微镜观察它在细胞内部的移动。
　　
　　钱永健探明GFP发出荧光的机制，发明多色荧光探针技术，创建GFP工程
　　
　　1994年，钱永健探索GFP的结构，从而找到GFP发光基因。在蛋白质编号lema中可以看到GFP发色团的骨架在左边。蛋白质链形成一个桶状(蓝色)，子链的一部分直接从中间穿过(绿色)，发色团刚好在桶样结构中间，它被保护起来以免受周围环境的影响。这种保护对于发射荧光的必需的。一旦发色团吸收一个光子，激活的水分子通常就会夺取它的能量。但是在蛋白质内部改为发射能量稍低的光子来释放能量，使它得到了保护。发色团由蛋白质链上的三个氨基酸甘氨酸，酪氨酸和苏氨酸(或丝氨酸)自发形成。
　　1995年，钱永健的研究取得重大突破一发明了多色荧光探针技术。他采用核苷酸的定点诱变技术，完成了GFP的单点突变(S65T)。这个突变显著提高了GFP的光谱性质，荧光强度和光稳定性也大大增强。他还用点突变改变了GFP的折叠能力，从而产生了增强型GFP即EGFP。
　　其他的突变还包括颜色突变，这其中大部分也是钱永健的功劳。他先后发现了蓝色荧光蛋白(EBFP)、青色荧光蛋白(ECFP)和黄色荧光蛋(YFP)。
　　荧光蛋白广泛用于生学研究。通过常规的基因操纵手段，将荧光蛋白用来标记其他目标蛋白，这样可以观察、跟踪目标蛋白的时间、空间变化，提供了以前不能达到的时间和空间分辨率，而且可以在活细胞、甚至活体动物中观察到一些分子。荧光蛋白技术还使得人们可以研究某些分子的活性。
　　钱永健发现GFP在研究活细胞方面具有惊人的作用，成为GFP学科的创建者。在他的发现指引下科学家正在改进GFP分子以使其发出不同颜色的荧光。科学家目前可以制造蓝色荧光蛋白，黄色荧光蛋白和大量其他颜色的荧光蛋白质。方法是使发色团产生能改变其稳定性的小的变异，科学家还利用GFP来发明生理传感器：一种感应离子或酸碱度水平，然后通过发出特征性的荧光来报告结果的分子机器。
　　在钱永健发明的指引下，荧光蛋白在探索生命奥秘领域已有非常广泛的应用，GFP可应用于转染细胞的确定，体内基因表达的测定，蛋白质分子的定位和细胞间分子交流的动态监测，免疫分析、核酸碱基探针分析，以及分子间第二信使钙离子和cAMP水平的指示，细胞间隙pH变化的检测。另外，GFP也可以和其他蛋白质形成融合蛋白，作为基因治疗检测指标。
　　钱永健是GFP工程的创新者。GFP的用途已经扩展到艺术和商务领域，艺术家通过把GFP插入兔子细胞内创造出一个只荧光的绿色兔子。育种工作者正在探索利用GFP来创造特殊的荧光植物和各种鱼类，GFP已经被移植到大鼠、老鼠、青蛙、有翅昆虫、蠕虫以及不计其数的其他生物体内。