不同取代基羧甲基壳聚糖对冷藏河豚鱼品质的影响_羧甲基壳聚糖

　　摘要：研究了不同取代基羧甲基壳聚糖对冷藏河豚鱼品质的影响。用质量浓度均为０．0５ g/L的羧甲基壳聚糖、Ｎ，Ｏ－羧甲基壳聚糖、Ｏ－羧甲基壳聚糖水溶液浸泡鱼肉，装袋后置于４ ℃的冰箱中冷藏。以细菌总数（TVC）、挥发性盐基氮（ＴＶＢ－Ｎ）、ｐＨ值、硫代巴比妥酸（ＴＢＡ）以及三甲胺（ＴＭＡ）为评价指标，测定河豚鱼冷藏过程中的品质变化。结果表明，不同取代基的羧甲基壳聚糖均能够有效地抑制细菌的增殖，延缓ｐＨ值、ＴＶＢ－Ｎ、ＴＢＡ和ＴＭＡ含量的上升；其中，Ｏ－羧甲基壳聚糖保鲜效果尤为显著，优于其他取代基的羧甲基壳聚糖，可以有效地延长冷藏河豚鱼的货架期。
　　关键词：河豚鱼；羧甲基壳聚糖；冷藏；保鲜
　　中图分类号：ＴＳ２５４．４文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０11）15－3131-05
　　
　　Ｅｆｆｅｃｔs ｏｆ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｅｎｔ ｏｆ Ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌ Ｃｈｉｔｏｓａｎ ｏｎ Ｃｏｌｄ Ｓｔｏｒａｇｅd Ｐｕｆｆｅｒ Ｆｉｓｈ Ｑｕａｌｉｔｙ
　　
　　ＭＡ Ｙａｎ，ＸＩＥ Ｊｉｎｇ，ＺＨＯＵ Ｒａｎ，ＬＩＵ Ｙｕａｎ
　　（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｏｃｅａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｓｈａｎｇｈａｉ ２０１３０６， Ｃｈｉｎａ）
　　
　　Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ of different substiluent of carboxymethyl chitosan on ｔｈｅ ｑｕａｌｉｔｙ ｏｆ ｐｕｆｆer ｆｉｓｈ ｄｕｒｉｎｇ ｃｏｌｄ ｓｔｏｒａｇｅ ｗｅｒｅ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ． Ｐｕｆｆer ｆｉｓｈ ｓａｍｐｌｅｓ ｗｅｒｅ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ ｔｒｅａｔｅｄ ｂｙ ｓｏａｋing ｉｎ ０．５％ ｏｆ ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌ ｃｈｉｔｏｓａｎ， Ｎ，Ｏ－ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌ ｃｈｉｔｏｓａｎ ａｎｄ Ｏ－ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌ ｃｈｉｔｏｓａｎ， ｔｈｅｎ ｐａｃｋａｇｅｄ ａｎｄ ｓｔｏｒｅｄ ａｔ ４ ℃． Ｓｅｖｅｒａｌ ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ ｗｅｒｅ determined ｔｏ ｅｖａｌｕａｔｅ ｔｈｅ ｑｕａｌｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ ｔｒｅａｔｅｄ ｐｕｆｆer fiｓｈ ｓａｍｐｌｅｓ， ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｔｈｅ ｔｏｔａｌ ｖｉａｂｌｅ ｃｏｕｎｔ， ＴＶＢ－Ｎ， ｐＨ， ＴＢＡ ａｎｄ ＴＭＡ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｕｂｓｔｉｔｕｅｎｔ ｏｆ ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌ ｃｈｉｔｏｓａｎ ｅｓｐｅｃｉａｌｌｙ ｔｈｅ Ｏ－ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌ ｃｈｉｔｏｓａｎ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ ｔｈｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ of bacteria ａｎｄ ｓｌｏｗｅｄ ｄｏｗｎ ｔｈｅ ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ ｏｆ ＴＶＢ－Ｎ， ｐＨ， ＴＢＡ ａｎｄ ＴＭＡ． Ｔｈｕｓ， ｉｔ was ｓｕｇｇｅｓｔｅｄ ｔｈａｔＯ－ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌ ｃｈｉｔｏｓａｎ ｃｏｕｌｄ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ ｏｆ ｐｕｆｆer ｆｉｓｈ．
　　Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｐｕｆｆer ｆｉｓｈ； ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌ ｃｈｉｔｏｓａｎ； ｃｏｌｄ ｓｔｏｒａｇｅ； ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ
　　河豚鱼（Ｐｕｆｆｅｒ ｆｉｓｈ）又名�，有上百个种类，几乎所有种类的河豚都含有河豚毒素。河豚虽然有剧毒，但是其肉鲜美柔嫩，日本［１］、朝鲜和我国［２］都有食用河豚的传统习惯。我国的河豚鱼资源非常丰富，产于我国的河豚鱼有４０余种，是世界上河豚鱼的产销大国［３］。目前，河豚鱼一般以鲜活形式进行销售，但是随着其产量和市场需求的迅速增加，对河豚鱼进行贮藏保鲜处理势在必行。鱼肉中的水分含量很高，其腮、内脏也带有一定量的细菌，如不采取适当的贮藏保鲜方法，极易导致鱼肉腐败，从而影响市场的流通和销售。因此，在捕捞、运输和加工过程中必须采取有效的贮藏保鲜措施，以满足市场和消费者的需求。
　　壳聚糖（Ｃｈｉｔｏｓａｎ）又名脱乙酰甲壳质、可溶性甲壳素，化学名称为β－（１，４）－２－氨基－２－脱氧－Ｄ－葡萄糖，是一种天然高分子聚合物，具有无毒、无害及较好的成膜性，并且具有较强的抑菌作用，在食品贮藏保鲜方面有很高的应用价值［４，５］。壳聚糖是由甲壳质经脱乙酰化制得，由于壳聚糖不溶于水，因此其应用受到很大的限制［６，７］。将壳聚糖羧甲基化得到不同取代基的羧甲基壳聚糖，其易溶于水，在水溶液中容易形成较为牢固的膜，此膜对气体有选择渗透性，适用于不同产品的保鲜。连玉晶等［８］研究利用羧甲基壳聚糖涂抹液对油豆角进行保鲜，结果表明，羧甲基壳聚糖延长了油豆角的贮藏期，保持了油豆角的品质风味。徐丽敏等［９］采用水溶性壳聚糖对南美白对虾进行保鲜处理，发现壳聚糖对南美白对虾体内腐败菌的增殖有不同程度的抑制作用。尽管前人利用羧甲基壳聚糖作为保鲜剂在水产品贮藏保鲜效果方面进行了大量的研究，但是一般只研究了一种取代基的羧甲基壳聚糖，而采用多种不同取代基的羧甲基壳聚糖对冷藏河豚鱼品质影响的研究尚未见报道。为了延长河豚鱼在冷藏条件下的货架期，本试验研究了不同取代基羧甲基壳聚糖对河豚鱼冷藏保鲜过程中鱼肉品质的影响，以期为河豚鱼贮藏保鲜技术的发展提供一定的理论参考。
　　１材料与方法
　　１．１试验材料
　　暗纹东方�（Takifugu obscurus），购自上海能正渔业科技开发有限公司，选取大小一致、体重为５００ ｇ左右的健康河豚鱼。
　　１．２仪器与试剂
　　Ｋｊｅｌｔｅｃ２３００凯氏定氮仪（瑞士Ｆｏｓｓ公司）；ＰＢ－１０精密数显酸度计（德国Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ公司）；ＨＶＥ－５０灭菌锅（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）；洁净工作台（苏净安泰空气技术有限公司）；ＴＤＬ－５型低速离心机（上海安亭科学仪器厂）；Ｕｎｉｃｏ ２１００分光光度计（尤尼柯仪器有限公司）。
　　主要试剂：羧甲基壳聚糖、Ｎ，Ｏ－羧甲基壳聚糖及Ｏ－羧甲基壳聚糖均购自浙江澳兴生物科技有限公司；营养琼脂、硼酸、轻质氧化镁、甲基红、溴甲酚绿、硫代巴比妥酸、三氯乙酸等购自国药集团化学试剂有限公司，均为分析纯。
　　１．３试验方法
　　１．３．１样品处理新鲜河豚鱼去头去尾去内脏，用冰水洗净，沥干，分成１０ ｇ左右的鱼块。试验分为４组，１组将鱼肉直接装袋后放入４ ℃冰箱中，作为对照组；另外３个组为试验组，将鱼肉分别放入质量浓度均为０．0５ g/L的羧甲基壳聚糖、Ｎ，Ｏ－羧甲基壳聚糖及Ｏ－羧甲基壳聚糖水溶液中浸泡１０ ｓ，装袋，置于４ ℃冰箱中冷藏。试验中河豚鱼冷藏保鲜６ ｄ，每隔２４ ｈ取样１次，分别进行细菌总数（TVC）、挥发性盐基氮（TVB-N）、ｐＨ值、硫代巴比妥酸（TBA）、三甲胺（TMA）的测定。
　　１．３．２ＴＶＣ的测定参照文献［１０］中的方法进行。
　　１．３．３ＴＶＢ－Ｎ的测定参照文献［１１］的方法，应用半微量凯氏定氮的原理，采用Ｋｊｅｌｔｅｃ２３００自动凯氏定氮仪测定挥发性盐基氮的含量。
　　１．３．４ｐＨ值的测定将样品鱼肉剁碎后称取５．００ ｇ于烧杯中，加入中性蒸馏水至５０ ｍＬ，搅拌均匀后静置３０ ｍｉｎ，用精密数显酸度计测定ｐＨ值［１２］。
　　１．３．５ＴＢＡ的测定参照Ｓａｌｉｈ等［１３］的方法，略有修改，具体如下：将样品鱼肉切碎后，准确称取５．００ ｇ于烧杯中，加入１５ ｍＬ体积分数为２０％的三氯乙酸（ＴＣＡ）溶液和１０ ｍＬ去离子水，匀浆６０ ｓ，静置１ ｈ后过滤，滤液用去离子水定容至５０ ｍＬ，取５ ｍＬ滤液加入５ ｍＬ ０．０２ ｍｏｌ／Ｌ的TBA溶液，沸水浴中反应２０ ｍｉｎ，取出，流动水冷却５ ｍｉｎ后用分光光度计在５３２ ｎｍ处测吸光度值Ａ。空白值：取２５ ｍＬ 体积分数为２０％的ＴＣＡ溶液，用去离子水定容至５０ ｍＬ，然后取５ ｍＬ滤液加５ ｍＬ ０．０２ ｍｏｌ／Ｌ 的ＴＢＡ溶液，方法同上。ＴＢＡ含量以１００ ｇ样品鱼肉中含有的丙二醛的毫克数表示。参照文献［13］的标准曲线，ＴＢＡ值＝７．８Ａ（ｍｇ／１００ ｇ）
　　１．３．６ＴＭＡ的测定采用苦味酸法［１２］进行测定，标准曲线如图１所示。ＴＭＡ含量以１００ ｇ样品鱼肉中含有的TMA的毫克数表示。
　　１．４数据分析
　　试验数据采用ＳＰＳＳ １７．０软件的Ｄｕｎｃａｎ＇ｓ法进行多重比较和方差分析，结果用平均数±标准差（ｘ±ｓ）表示，采用Ｅｘｃｅｌ ２００７绘制曲线。
　　２结果与分析
　　２．１细菌总数（ＴＶＣ）的变化
　　ＴＶＣ作为水产品被微生物污染程度的重要指标，是评价冷藏水产品品质和货架期的一个非常有效的工具［１４］。河豚鱼在冷藏保鲜期间TVC的变化情况如表１所示，新鲜河豚鱼的TVC为１．２０２×１０３ ＣＦＵ／ｇ。在整个冷藏过程中，对照组河豚鱼肉的TVC高于各试验组，细菌增殖速度较快，在第一天就出现了显著差异（Ｐ＜０．０５），在第四天对照组TVC已经超过了鱼肉的可食用上限１．０００×１０５ ＣＦＵ／ｇ［１５］，达到了１．１７５×１０５ ＣＦＵ／ｇ。在冷藏期结束时，对照组鱼肉的TVC为新鲜河豚鱼的２ ９３８．０９倍；羧甲基壳聚糖组为１ ３４９．２６倍；Ｎ，Ｏ－羧甲基壳聚糖组为９８８．７７倍；Ｏ－羧甲基壳聚糖组为４７８．７４倍。TVC的变化特征表明羧甲基壳聚糖能够抑制细菌的增殖，具有较好的抑菌作用，与Ｆａｎ等［１６］用壳聚糖对银鲤进行保鲜处理得出的结论类似。不同取代基的羧甲基壳聚糖的抑菌效果各不相同，其中Ｎ，Ｏ－羧甲基壳聚糖组和Ｏ－羧甲基壳聚糖组的抑菌效果优于羧甲基壳聚糖组。在冷藏第一天，羧甲基壳聚糖组TVC与其他２个试验组之间出现显著差异（Ｐ＜０．０５）；冷藏的前３ ｄ，Ｎ，Ｏ－羧甲基壳聚糖组和Ｏ－羧甲基壳聚糖组的TVC差异不大，从第四天开始，其抑菌效果开始出现显著差异（Ｐ＜０．０５）。Ｏ－羧甲基壳聚糖和其他取代基的羧甲基壳聚糖相比，具有较好的抑菌作用，可能是由于Ｏ－羧甲基壳聚糖具有更好的成膜性，在一定程度上阻止了鱼体表面与空气的接触，抑制了细菌的生长繁殖。
　　２．２挥发性盐基氮（ＴＶＢ－Ｎ）含量的变化
　　TVB-N被作为评价冷藏水产品品质的指标已得到广泛的应用［１７］。TVB-N主要是由鱼肉中蛋白氮和非蛋白氮的降解形成［１８］。由图２可知，对照组的ＴＶＢ－Ｎ含量在贮藏保鲜期间急剧上升，在第六天达到１８．６３ ｍｇ／１００ ｇ。ＴＶＢ－Ｎ含量随着贮藏时间的延长而上升，经过羧甲基壳聚糖处理过的河豚鱼肉ＴＶＢ－Ｎ含量增长趋势均缓于对照组，在冷藏期结束时试验组ＴＶＢ－Ｎ含量分别为：羧甲基壳聚糖组１７．２６ ｍｇ／１００ ｇ； Ｎ，Ｏ－羧甲基壳聚糖组１６．４０ ｍｇ／１００ ｇ；Ｏ－羧甲基壳聚糖组１６．１１ ｍｇ／１００ ｇ。
　　杨胜平等［１９］研究了壳聚糖在带鱼冷藏中的保鲜作用，结果表明，壳聚糖涂膜能较好地维持带鱼的新鲜度，延缓其ＴＶＢ－Ｎ含量的升高。由图２可知，羧甲基壳聚糖可有效减缓河豚鱼肉ＴＶＢ－Ｎ含量的上升，不同取代基的羧甲基壳聚糖对ＴＶＢ－Ｎ含量上升的减缓程度各不相同，Ｏ－羧甲基壳聚糖和其他取代基的羧甲基壳聚糖相比，效果更好。不同种类鱼的氨基酸组成有差异，在冷藏过程中鱼肉ＴＶＢ－Ｎ产生的速度及数量也会不同。据文献报道，６０ ｍｇ/１００ ｇ可作为鳕鱼鱼肉中ＴＶＢ－Ｎ的上限［２０］，３５～４０ ｍｇ／１００ ｇ可作为银鲤的上限［１６］，由此可知，不同鱼肉ＴＶＢ－Ｎ的上限不同。河豚鱼的ＴＶＢ－Ｎ的上限约为１２～１３ ｍｇ／１００ ｇ，由于其特殊的肉质结构，在冷藏过程中其ＴＶＢ－Ｎ含量一直处于较低的水平，因此，在对河豚鱼的新鲜度进行综合评价时，ＴＶＢ－Ｎ并不是较理想的考察指标。
　　２．３ｐＨ值的变化
　　ｐＨ值的变化是鱼肉贮藏期变化的主要特征。动物屠宰后，在机体内各种酶和外界微生物的共同作用下，出现尸僵－成熟－自溶－腐败等一系列变化，这些变化是由肌肉中的生化反应和微生物的分解双重作用引起的［２１］。鱼死后僵硬，体内糖原酵解产生大量乳酸，ＡＴＰ酶活性增强，使得肌肉中的ｐＨ值降低。而当鱼体肌肉中的ＡＴＰ分解完后，鱼体开始软化，先后进入自溶和腐败阶段，蛋白质和其他一些含氮物质被分解为氨基酸、氨、三甲胺、硫化氢、吲哚等碱性物质，此时鱼体ｐＨ值又回升，因此鱼体宰杀后ｐＨ值呈先下降后上升的趋势，是与其品质变化相联系的［２２］。
　　由图３可知，新鲜河豚鱼肉的ｐＨ值为６．６２，在整个冷藏过程中试验组和对照组河豚鱼肉中的ｐＨ值均呈现先下降后上升的趋势，在冷藏第一天鱼肉中的ｐＨ值最低。与对照组相比，试验组鱼肉的ｐＨ值变化较平缓，从第三天开始，对照组鱼肉ｐＨ值和试验组之间出现显著差异（Ｐ＜０．０５）。在前３ ｄ的冷藏中，各试验组之间ｐＨ值差异不显著，从第四天开始出现显著差异（Ｐ＜０．０５）。结合表１的细菌总数变化情况，可能是由于羧甲基壳聚糖在一定程度上抑制了细菌的增殖，延缓了河豚鱼的解僵时间，即达到保鲜的目的。不同取代基羧甲基壳聚糖组之间，Ｏ－羧甲基壳聚糖组的pH值变化较为平缓，具有较好的保鲜效果。
　　２．４硫代巴比妥酸（ＴＢＡ）含量的变化
　　ＴＢＡ被广泛用于水产品以及肉制品的脂肪氧化酸败程度的测定，是衡量肉制品中脂肪氧化程度的良好指标。鱼肉中的脂肪氧化会产生一些令人不愉快的味道，同时还会对鱼肉的品质产生影响［２３］。如图４所示，新鲜河豚鱼的ＴＢＡ含量较小，为０．0３０ ３ ｍｇ／１００ ｇ，说明脂肪氧化不显著，随着冷藏时间的延长，ＴＢＡ含量随之增加。对照组在冷藏期间ＴＢＡ含量增长迅速，与试验组相比，差异显著（Ｐ＜０．０５），在第六天对照组ＴＢＡ含量达到0．１1８ ｍｇ／１００ ｇ。各试验组之间ＴＢＡ含量变化各不相同，但上升趋势均较为缓慢，可能是由于羧甲基壳聚糖涂膜在样品表面，在一定程度上阻止了鱼肉与外界空气的接触，从而减缓了鱼肉中脂肪的氧化酸败。由此可知，羧甲基壳聚糖可以有效地保持鱼肉品质，达到保鲜效果，其中，Ｏ－羧甲基壳聚糖与另外两种羧甲基壳聚糖相比，保鲜效果更佳。
　　２．５三甲胺（ＴＭＡ）含量的变化
　　TMA是评价鱼的新鲜度的指标之一［２４］。氧化三甲胺广泛分布于猪肉、鱼和虾中，它具有一种特殊的鲜味。氧化三甲胺在微生物和酶的作用下降解生成TMA和二甲胺，TMA的含量越高，说明肉制品的新鲜度越差［２５］。如图５所示，新鲜河豚鱼的TMA含量仅有０．４２７ ｍｇ/１００ ｇ。随着冷藏时间的延长，鱼肉中的ＴＭＡ含量升高，鱼的新鲜度下降。在整个冷藏过程中，经过羧甲基壳聚糖处理的鱼肉中TMA含量均低于对照组，这可能是由于羧甲基壳聚糖具有良好的抑菌作用，抑制了微生物的增殖，减慢了鱼肉的腐败。其中，用Ｏ－羧甲基壳聚糖处理的鱼肉TMA含量最低，保鲜效果最佳。
　　３结论
　　用不同取代基的羧甲基壳聚糖处理冷藏河豚鱼后发现，在４ ℃冷藏保鲜条件下，羧甲基壳聚糖可以有效地抑制鱼肉中细菌的增殖，减缓ＴＶＢ－Ｎ含量的上升；且经过不同取代基的羧甲基壳聚糖涂膜后，鱼肉的ｐＨ值、ＴＢＡ含量以及TMA含量均低于对照组。试验表明，羧甲基壳聚糖具有一定的抑菌作用，不同取代基的羧甲基壳聚糖保鲜效果各不相同。综合冷藏河豚鱼的各项指标，Ｏ－羧甲基壳聚糖在４ ℃冷藏条件下的保鲜效果要优于Ｎ，Ｏ－羧甲基壳聚糖和羧甲基壳聚糖，可以有效地延长河豚鱼的货架期。因此，Ｏ－羧甲基壳聚糖可作为一种新型的水产品生物保鲜剂，具有非常广阔的应用前景。
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