发酵碳源 碳源对_聚谷氨酸发酵的影响

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2010No．3Serial No．216

China Brewing

Research Report

碳源对γ-聚谷氨酸发酵的影响

缪

静，杨在东，冯志彬，张玉香，程显好

（鲁东大学生命科学学院，山东烟台264025）

摘要：以γ-聚谷氨酸生产菌yt102为供试菌株，研究了碳源对γ-聚谷氨酸发酵的影响。首先通过摇瓶实验确定发酵的最佳碳源为葡

萄糖和柠檬酸，二者按一定的比例混合更有利于聚谷氨酸的产生，进一步利用10L 发酵罐补料分批发酵确定碳源的最佳用量为40g/L，继续优化培养条件，确定采用溶氧控制的脉冲补料方式可有效延续γ-聚谷氨酸的合成。在最优发酵条件下，通过10L 发酵罐补料分批发酵50h ，γ-聚谷氨酸产量可达34.5g/L。关

键

词：γ-聚谷氨酸；碳源；枯草芽孢杆菌；优化培养

文献标识码：A

文章编号：0254-5071（2010）03-0070-03

中图分类号：Q934

Effect of carbon source on γ-polyglutamic acid production

MIAO Jing, YANG Zaidong, FENG Zhibin, ZHANG Yuxiang, CHENG Xianhao

(Collegeof Life Science, Ludong University, Yantai 264025, China)

Abstract:Effect of carbon source on the production of γ-polyglutamic acid (γ-PGA) were studied with Bacillus subtilis yt102. Effects of different carbon sources on γ-polyglutamic acid yield and cell mass were evaluated with shaking flasks. The results showed that glucose and citric acid were the optimal carbon sources, and production of γ-polyglutamic acid was improved when using combined two carbon sources. Futher study showed that high γ-polyglutamic acid yield was obtained when 40g/Lcarbon source was added to fermentation medium and DO-control pulse fed-batch was adopted. Under optimum conditions, the production of γ-polyglutamic acid could reach 34.5g/L.Key words:γ-polyglutamic acid; carbon source; Bacillus subtilis ; optimization of fermentation

γ-聚谷氨酸（γ-PGA ）是由D 型或L 型谷氨酸通过α-氨基和γ-羧基间的γ-酰胺键连接而成的多肽分子，通常由5000个左右的谷氨酸单体组成，分子质量一般在1×102u~1×103u 。其在自然界或人体内为能被生物降解的内源性物质，不易产生积蓄或毒副作用[1-3]。

其分子链上存在大量的游离羧基，所以具有极佳的成膜性、成纤维性、阻氧性、可塑性、粘结性、保湿性和生物降解等独特的理化和生物学特性。如高活性的羧基可与一些药物结合生成较稳定的复合物，在体内可被溶酶体降解为内源性谷氨酸，并释放出药物，是一种理想的药物载体。作为药物载体，其可以提供药物缓释性、靶向性，提高药物扩大药物适用范围[4-5]。其在食水溶性，从而提高药物疗效、品、农业、化妆品、塑料、分散剂、螯合剂、建筑材料等领域都具有广泛的应用潜力[6-7]。本实验以γ-PGA 生产菌yt102为研究对象，对碳源种类、碳源浓度及流加方式对γ-PGA 合成的影响进行了研究。1材料与方法1.1菌种

枯草芽孢杆菌yt102：鲁东大学生命科学学院筛选保藏。1.2培养基及培养条件

种子培养基：葡萄糖20g/L，酵母膏5g/L，胰蛋白胨10g/L，NH 4Cl 2.5g/L，KH 2PO 42g/L，MgSO 40.4g/L，谷氨酸钠10g/L，pH 7.0。

收稿日期：2009-09-08

发酵培养基：葡萄糖30g/L，谷氨酸钠30g/L，CaCl 2

1g/L，KH 2PO 41.5g/L，MgSO 40.5g/L，酵母粉30g/L，柠檬酸1.2g/L，NH 4Cl 7g/L，MnSO 450mg/L，FeCl 320mg/L，pH 7.2。1.3培养方法

种子培养：500mL 三角瓶内装50mL 种子培养基，接种37℃、200r/min摇床培养13h 。活化后的斜面菌种1环，

摇瓶发酵培养：按5%的接种量将种子培养基接入发500mL 三角瓶装液量为100mL ，240r/min、酵培养基中，37℃培养50h 。

10L 罐发酵培养：按5%接种量将种子液接入10L 发酵罐中；搅拌转速500r/min~800r/min；维持pH7.0，培养温度37℃，以泡敌消泡，发酵过程中每间隔一定时间取样进行各项参数测定。1.4分析方法1.4.1菌浓测定

吸取样品菌液，用蒸馏水稀释一定倍数，以蒸馏水作为空白对照，采用752分光光度计于1cm 光程测定OD 600nm 。1.4.2葡萄糖、谷氨酸含量

采用SBA-40C 生物传感器测定。1.4.3γ-PGA 的测定

发酵液离心去除菌体，测定上清液中谷氨酸单体的含量，然后将上清液与12mol/L盐酸按1∶1的体积比混和加入水解管中，抽真空后封口，于110℃水解24h ，最后测定水解

基金项目：山东教育厅科技计划项目（J08LE55）；鲁东大学学科建设经费资助项目（203-07000108）作者简介：缪

静（1972-），女，副教授，主要从事发酵工程的教学与科研工作。

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液中谷氨酸总量，水解前后的谷氨酸之差为γ-PGA 的含量[8]。

2结果与讨论

2.1不同碳源对γ-聚谷氨酸发酵的影响

选择可溶淀粉、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、柠檬酸及甘油7种碳源，在500mL 摇瓶中进行发酵，结果见表1。

表1碳源可溶性淀粉葡萄糖蔗糖麦芽糖乳糖柠檬酸甘油

不同碳源对γ-聚谷氨酸发酵的影响

Table 1. Effect of different carbon sources on γ-PGA fermentation

OD 值

0.8071.0231.0870.9650.9781.0021.032

γ-PGA/（g ·L -1）

11.717.813.412.311.218.017.6

由表1可知，γ-聚谷氨酸生产菌yt102能利用供试的7种碳源生长并合成γ-聚谷氨酸，其中以柠檬酸为碳源时，γ-PGA 产量最大；葡萄糖及甘油次之，但相差不大；其他供试碳源均不能获得较高的γ-聚谷氨酸产量。同时也可看出，7种碳源对γ-聚谷氨酸生产菌的生物量并没有明显的影响，综合考虑生产成本和原料的可获得性，选择葡萄糖和柠檬酸作为γ-聚谷氨酸发酵的碳源。

2.2不同碳源比例对γ-聚谷氨酸发酵的影响

以葡萄糖和柠檬酸为碳源，按不同比例混合，在500mL 摇瓶中进行发酵，考察对γ-聚谷氨酸发酵的影响，结果见表2。

表2

不同碳源比例对γ-聚谷氨酸发酵的影响

附图不同碳源浓度对菌体生长(A)，γ-PGA 产量(B)的影响Attached figure. Different concentration of carbon source on cell

growth(A),γ-PGA

production(B)

由附图A 可知，碳源浓度为20g/L时，对菌体初期生长最为有利，但达到平衡期后菌体终浓度偏低，且较早衰退；浓度达到80g/L时，对菌体的初期生长有一定的抑制作用；当碳源浓度为40g/L~60g/L时，菌体生长较为有利，且碳源浓度为60g/L时，菌体生长量最高。由附图B 可知，初始碳源浓度为20g/L时，该菌前期产γ-聚谷氨酸较多，但碳源

80g/L时消耗快利用效率低不利于发酵后期产物的积累；较高的碳源浓度已经抑制了γ-聚谷氨酸的产生，整个发酵60g/L的碳源过程聚谷氨酸的产量始终处于较低的水平；

浓度虽然获得最高的菌体生长量，但相对40g/L的碳源浓度后期γ-聚谷氨酸的生成量偏低；碳源浓度为40g/L时，γ-聚谷氨酸的产量最高，同时具有较高的转化率，且对菌体生长无明显的抑制作用，故选择40g/L为γ-聚谷氨酸发酵碳源的初始浓度。

2.4碳源流加方式对γ-聚谷氨酸发酵的影响

流加操作是指在培养过程中定期向反应器中加入培养

基，但并不同时取出培养液的方法。根据γ-聚谷氨酸实际发酵过程的特点，按照反馈参数和流加方式的不同，考察恒速流加、恒碳源浓度流加、指数速率流加及溶氧控制的脉冲流加等流加方式对γ-聚谷氨酸发酵的影响，结果见表3。

恒速流加即补料液在整个发酵过程中一直保持恒定流速不变，此种补料方式碳源在发酵前期和稳定期后期相对过量，在主生产期不足，受碳源浓度的影响，发酵前期菌体生长较快，活力衰退较快，产物浓度不高。恒碳源浓度流加是根据上一时间间隔的碳源消耗量预测下一时刻的

Table 2. Effect of different ratios of carbon sources on γ-PGA

fermentation

葡萄糖∶柠檬酸添

1∶110∶125∶150∶1100∶1

OD 值

0.9870.9831.0020.9760.969

γ-PGA/（g ·L ）

20.920.321.021.318.0

-1

由表2并结合表1可知，葡萄糖和柠檬酸共同作为碳源比二者单独作为碳源的效果要好，且当二者比例小于50∶1时效果明显，继续增加柠檬酸的比例不能提高γ-聚谷氨酸的产量，因此选择50∶1作为合适的比例。2.3不同碳源浓度对γ-聚谷氨酸发酵的影响

以葡萄糖和柠檬酸按50∶1比例混合作为碳源，分别按20g/L、40g/L、60g/L及80g/L添加到发酵培养基，在10L 自动发酵罐发酵，当残糖浓度降至10g/L时流加一定量的碳源，考察碳源浓度对γ-聚谷氨酸产量的影响，结果见附图。

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碳源消耗量，从而将流速调至合适值，保持碳源浓度的恒定。但由于在线测量的不易实现，碳源浓度需离线测量，只能预测补充碳源，补入的碳源量可能不合适，影响菌体生长和产物的有效合成，但发酵效果要优于恒速补料。指数速率流加是指补料速率随时间成指数关系的流加方式，这种流加方式的特点是菌体数量增长过快，而产品浓

溶氧控制的脉冲流加，根据溶氧值（DO ）随时控度并不高。

制流加速率，DO 值上升表明碳源量不足，应增加补料速率，使溶氧值保持在合适范围内。此方式补充碳源迅速，过程控制灵敏，且脉冲补料是一种振荡补料方式，可引起菌体共谐，

在此方式下菌体生长基质内营养物质更易为菌体充分利用。

和γ-聚谷氨酸产量均取得了良好的效果，发酵50h ，菌体OD 值最高为0.983，γ-聚谷氨酸产量可达34.5g/L。

表3

碳源流加方式对γ-PGA 发酵的影响

入主发酵期菌体增长无力，γ-聚谷氨酸终产量不高；高浓度

γ-聚谷氨酸产量较低，且发酵碳源发酵前期抑制菌体生长，

因此合适的碳源初始浓度对γ-聚谷氨酸发周期明显延长。

在恰当的时机补入碳源可以延长γ-聚谷氨酸酵十分重要。

生产菌的发酵能力，研究发现采用溶氧控制的脉冲补料方式可以根据溶氧变化确定补料时机和补料速率，对发酵最为有利。参考文献：

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polyglutamic acid synthesis by glutamate in Bacillus licheniformis and

Table 3. Effect of feed method on γ-PGA fermentation 流加方式恒速流加恒碳源流加指数速率流加溶氧控制的脉冲流加

OD 值

1.0030.9321.1120.983

γ-PGA/（g ·L -1）

26.730.826.234.5

3结论

研究通过摇瓶发酵比较7种碳源对γ-聚谷氨酸发酵的影响发现，葡萄糖及柠檬酸为碳源对γ-聚谷氨酸合成较为有利，进一步研究发现2种碳源具有协同作用，当二者以一

在定比例混合作为碳源比二者单独作为碳源时效果要好。

10L 自控发酵罐上研究碳源初始浓度对γ-聚谷氨酸发酵的影响，结果表明，低浓度碳源发酵前期菌体生长较快，但进

Bacillussubtilis [J].Appl Environ Microbiol ,2001,67(2):1004-1007.

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