【利用定量ＰＣＲ方法检测盐、磷对菌根真菌侵染紫云英的影响】菌根对磷吸收
摘要：建立了菌根真菌（ＡＭF）的ＤＮＡ含量和ＴＢ染色所观察的侵染率之间的相关性曲线。将荧光定量ＰＣＲ技术运用到ＡＭＦ对植物紫云英（Ａｓｔｒａｇａｌｕｓ ｓｉｎｉｃｕｓ Ｌ．）的侵染率检测中，实现了混合侵染条件下对菌根中ＡＭＦ的种类和侵染率同时进行定性和定量检测。在盆栽实验中，利用所建立的方法检测了不同盐、磷浓度及交互作用对ＡＭＦ侵染紫云英的影响，结果表明，不同磷浓度下，盐浓度的增加对Ｇｌｏｍｕｓ ｍｏｓｓｅａｅ和Ｇｌｏｍｕｓ ｉｎｔｒａｒａｄｉｃｅｓ侵染率的影响不同。Ｇ． ｉｎｔｒａｒａｄｉｃｅｓ在混合接种中占有绝对的优势。从ＡＭＦ对紫云英的促生效果上看，ＡＭＦ侵染率的增加提高了紫云英的抗盐胁迫能力，促进了植物生长。
关键词：定量ＰＣＲ；菌根真菌（ＡＭF）；紫云英（Ａｓｔｒａｇａｌｕｓ ｓｉｎｉｃｕｓ Ｌ．）；盐胁迫；磷
中图分类号：Ｑ９３９．５ 文献标识码：Ａ 文章编号：0439－８114（２０12）15－3193-05
Ｕｓｉｎｇ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｔｏ Ｄｅｔｅｃｔ ｔｈｅ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓ ａｎｄ Ｓａｌｔ ｏｎ ｔｈｅ
Ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＡＭ Ｆｕｎｇｕｓ ｔｏ Ａｓｔｒａｇａｌｕｓ ｓｉｎｉｃｕｓ Ｌ.
ＺＨＯＵ Ｙａｎ－ｆｅｉ，ＬＩＮ Ｈｕｉ，ＺＨＡＯ Ｂｉｎ
（Ｓｔａｔｅ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， Ｈｕａｚｈｏｎｇ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｗｕｈａｎ ４３００７０， Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｅ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｃｕｒｖｅｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ａｍｏｕｎｔｓ ｏｆ ｆｕｎｇａｌ ＤＮＡ ａｎｄ ｆｕｎｇａｌ ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｒｏｏｔ ｓｙｓｔｅｍ were established ｂｙ ｍｅａｎｓ ｏｆ ＴＢ ｓｔａｉｎ ｍｅｔｈｏｄ. Tｈｅ ＰＣＲ ｍｅｔｈｏｄ was ｕｓｅｄ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｔｈｅ ＡＭF ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ ｏｆ mixture ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ ｒｅｌｉａｂｌｙ． Ｉｔ ｃould ｂｅ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ｑｕａｌｉｔａｔｉｖｅ ａｎｄ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｓｐｅｃｉａｌ ｔａｘａ ｏｆ ＡＭＦ ｉｎ ｒｏｏｔｓ ａｎｄ ｓｏｉｌｓ ｃｏｌｏｎｉｚｅｄ ｂｙ ｓｅｖｅｒａｌ ｔａｘａ． Ｔｈｉｓ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｌｅｖｅｌ ｏｆ ｓａｌｔ ａｎｄ ｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓ ｏｎ ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＡＭ ｆｕｎｇａｌ ｔｏ Ａｓｔｒａｇａｌｕｓ ｓｉｎｉｃｕｓ Ｌ， which was ｃａｒｒｉｅｄ ｏｕｔ ｗｉｔｈ ａ ｇｒｅｅｎｈｏｕｓｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｗｈｉｌｅ ｔｈｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓ ｗａｓ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ， ｔｈｅ ｉｎｃｒｅａｓe ｏｆ ｓａｌｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｈａｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ ｔｈｅ ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｌｏｍｕｓ ｍｏｓｓｅａｅ ａｎｄ Ｇ. ｉｎｔｒａｒａｄｉｃｅｓ ｔｏ ｈｏｓｔ ｐｌａｎｔｓ． Ｗｈｉｌｅ ｉｎｏｃｕｌａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｍｉｘ ｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓ， ｐｌａｎｔｓ ｗｅｒｅ ｕｓｕａｌｌｙ ｄｏｍｉｎａｔｅｄ ｂｙ Ｇ． ｉｎｔｒａｒａｄｉｃｅｓ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｑＰＣＲ； ａｒｂｕｓｃｕｌａｒ ｍｙｃｏｒｒｈｉｚａ ｆｕｎｇｉ； Ａｓｔｒａｇａｌｕｓ ｓｉｎｉｃｕｓ Ｌ．； ｓａｌｔ ｓｔｒｅｓｓ； ｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓ
目前全世界已有８亿ｈｍ２的土地出现盐渍化［１］，严重影响了土地资源的利用，盐胁迫造成的低水势、Ｎａ＋毒害作用和营养元素分布不均衡，可使植物减产甚至不生长［２］。菌根真菌（ＡＭＦ）作为一类可以与地球上８０％的陆生植物共生的古老微生物［３］，能促进植物对土壤中Ｆｅ、Ｚｎ、Ｃｕ、Ｐ等矿质元素的吸收，调节宿主植物的代谢活动［４］，提高宿主植物抗重金属、抗旱和抗盐胁迫能力。盐对菌根的影响主要表现在减少孢子数量和抑制菌丝生长［５］，减少其再次侵染宿主的机会，降低菌根侵染率。尽管存在这种抑制作用，仍有大量研究结果表明ＡＭＦ可以提高宿主抗盐胁迫能力，不同ＡＭＦ抗盐胁迫的能力不一样，对植物生长的促生效果也不同［６］。
在生态系统中，同一宿主植物能被多种ＡＭＦ同时侵染，利用传统的ＴＢ染色和形态学观察方法难以对菌根中不同的ＡＭＦ进行区分［７，８］。而分子生物学方法可用于检测混合侵染的菌根中ＡＭＦ的组成［９］。实时荧光定量ＰＣＲ技术可以准确测定样品中特定基因的拷贝数。Ａｌｋａｎ等［１０，11］对Ｇｌｏｍｕｓ ｉｎｔｒａｒａｄｉｃｅｓ设计特异性引物，使用荧光定量ＰＣＲ方法第一次对单接种条件下菌根中ｒＤＮＡ进行了绝对定量，研究表明菌根总侵染率（包含菌丝、丛枝、泡囊）和荧光定量ＰＣＲ测得的结果之间具有相关性，相关性程度大小与宿主植物联系紧密。随后，进一步将该方法应用在双接种研究中，分别检测Ｇｌｏｍｕｓ ｍｏｓｓｅａｅ和Ｇ． ｉｎｔｒａｒａｄｉｃｅｓ在不同处理时的侵染率变化，发现不同处理下Ｇ． ｉｎｔｒａｒａｄｉｃｅｓ在苜蓿中都占绝对优势。Ｇａｍｐｅｒ等［１2］运用实时荧光定量的方法对５种ＡＭＦ进行定量分析，发现孢子数量和定量ＰＣＲ检测的结果之间有很强的相关性，定量ＰＣＲ方法的可行性取决于具体的实验内容，这种方法是研究生态系统中特定的ＡＭＦ总核酸量的有效方法。