百合多糖提取及成分分析:百合多糖

　　摘要：采用水提醇沉法提取百合（Ｂｕｌｂｕｓ ｌｉｌｉｉ）中的多糖成分，Ｓｅｖａｇｅ法除蛋白质，凝胶色谱法进行多糖纯化，制备３－甲基－１－苯基－２－吡唑啉酮（ＰＭＰ）衍生物进行高效液相色谱分析。结果表明，百合多糖由鼠李糖、阿拉伯糖、葡萄糖、木糖、半乳糖５种单糖组成，其含量分别为４．８２％、１２．７９％、４７．０２％、１３．０１％、２２．３６％。
　　关键词：百合（Ｂｕｌｂｕｓ ｌｉｌｉｉ）；多糖；提取；成分分析
　　中图分类号：Ｒ２８４．２ 文献标识码：Ａ 文章编号：0439－８114（２０12）15－3298-02
　　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ ｉｎ Ｂｕｌｂｕｓ ｌｉｌｉｉ
　　ＺＨＡＮＧ Ｇｕｏ－ｑｉａｎｇ，ＹＡＮＧ Ｚｈｅｎｇ－ｐｉｎｇ
　　（Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｆｏｏｄ， Ａｎｙａｎｇ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ａｎｙａｎｇ ４５５０００，Henan，Ｃｈｉｎａ）
　　Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｗａｓ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ａｎｄ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ Ｂｕｌｂｕｓ ｌｉｌｉｉ ｂｙ ｗａｔｅｒ ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ－ａｌｃｏｈｏｌ ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｂｙ Ｓｅｖａｇｅ ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ ｇｅｌ ｐｅｒｍｅａｔｉｏｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ． Ｔｈｅ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｗｅｒｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ａｎｄ ｑｕａｎｔｉｆｉｅｄ ｂｙ ＨＰＬＣ ｏｆ ｔｈｅ ＰＭＰ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｍａｉｎ ｍｏｎｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ ｃｏｎｔａｉｎｅｄ ｉｎ Ｂ. ｌｉｌｉｉ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｗｅｒｅ ｒｈａｍｎｏｓｅ， ａｒａｂｉｎｏｓｅ， ｇｌｕｃｏｓｅ， ｘｙｌｏｓｅ ａｎｄ ｇａｌａｃｔｏｓｅ， ｗｉｔｈ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ４．８２％， １２．７９％， ４７．０２％， １３．０１％ ａｎｄ ２２．３６％， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．
　　Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｂｕｌｂｕｓ ｌｉｌｉｉ； ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ； extraction； ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ａｎａｌｙｓｉｓ
　　百合（Ｂｕｌｂｕｓ ｌｉｌｉｉ）是百合科百合属多年生草本球根植物［１］，其味甘、微苦，具有补益心肺、调理脾胃、清热止痰之功效，对体虚肺弱、慢性支气管炎、肺气肿、肺结核及神经衰弱、失眠、高血压、胃溃疡等有一定疗效［２］，是传统的药食同源植物。现代医学研究发现百合多糖具有较为广泛的药理作用，包括抗氧化、抗肿瘤、降血糖与免疫调节等［３－５］。本研究对百合多糖的提取工艺及主要成分进行初步分析，以期为百合的综合利用提供一定的理论参考。
　　１ 材料与方法
　　１．１ 材料与仪器
　　百合购于河南省安阳市药材批发市场；乙醇、丙酮、三氟乙酸、３－甲基－１－苯基－２－吡唑啉酮（ＰＭＰ）、氢氧化钠、无水醋酸酐、氯仿等试剂为分析纯；标准单糖鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、葡萄糖、半乳糖为色谱纯。
　　仪器包括安捷伦１２６０高效液相色谱仪（配有紫外及蒸发光检测器，Ｃ１８柱）、电子分析天平、ＡＬＰＨＡＬ－２真空冷冻干燥机、真空干燥箱、ＲＥ５２－３旋转蒸发器、ＴＤＺ５－ＷＳ低速离心机、电子恒温水浴锅、ＣＳ１０１－ＩＣ型干燥箱、ＢＡＺ－１００自动分步收集器、ＤＨＬ－Ａ电脑恒流泵等。
　　１．２ 试验方法
　　１．２．１ 百合多糖的提取 ①百合多糖粗品的制备。称百合样品５．０００ ｇ，粉碎后加入１０倍体积的蒸馏水，调节溶液ｐＨ至１１，沸水浴提取２ ｈ，重复４次，过滤合并滤液，于６０ ℃真空浓缩至约５０ ｍＬ，以体积分数９５％的乙醇溶液沉淀，过滤，滤渣加５倍体积的丙酮—石油醚混合液（体积比１∶１），于６０ ℃水浴浸提１ ｈ，过滤，得沉淀，６０ ℃真空干燥１ ｈ，再于１０５ ℃干燥箱中烘干，即得灰白色的百合多糖粗品。②脱蛋白多糖的制备。取多糖粗品，加蒸馏水充分溶解，用Ｓｅｖａｇｅ法脱蛋白，离心，取上清液对流水透析４８ ｈ，再对蒸馏水透析２４ ｈ，无水乙醇沉淀，抽滤得沉淀，真空冷冻干燥，即得脱蛋白多糖。③多糖精品的制备。取适量脱蛋白的多糖，加蒸馏水充分溶解，上Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－７５凝胶色谱柱，用蒸馏水洗脱，４．５ ｍＬ／管自动分步收集，苯酚—硫酸法检测，合并主峰收集管液，６０ ℃真空浓缩，冷冻干燥得精制的百合多糖。
　　１．２．２ 多糖成分的分析 ①多糖水解。称取１０ ｍｇ精制的百合多糖样品于安瓿瓶中，加入２ ｍＬ ２ ｍｏｌ／Ｌ的三氟乙酸［６］，封管后置于１２０ ℃干燥箱中水解，２ ｈ后取出冷却，离心后取上清液，真空浓缩至干，得单糖样品置于干燥箱中备用。②单糖的衍生化。称取鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、葡萄糖、半乳糖标准品各１０ ｍｇ，分别加入单糖２倍物质的量的ＰＭＰ，调ｐＨ至１１，充分振荡溶解，于６０ ℃水浴反应３０ ｍｉｎ，取出冷却到室温，真空浓缩蒸干，用于液相色谱分析。多糖水解后所得单糖样品的衍生化操作方法相同。③液相色谱分析条件。Ｃ１８色谱柱，紫外检测器，检测波长２５０ ｎｍ，柱温为室温，进样量２０ μＬ，流动相溶剂Ａ：１５％乙腈＋２０ ｍｏｌ／Ｌ乙酸铵水溶液，溶剂Ｂ：４０％乙腈＋２０ ｍｏｌ／Ｌ乙酸铵水溶液，梯度洗脱程序为在０－１１５ ｍｉｎ内溶剂Ｂ的体积分数从０线性增加到１００％，流速１．２ ｍＬ／ｍｉｎ。
　　２ 结果与分析
　　将提取所得的百合多糖进样记录色谱图，参照单糖标准品的色谱图确定主要的指纹峰；采用国家药典委员会颁布的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”软件（２００４Ａ），将全谱导入后，经谱图处理，以软件自动生成的对照图谱为参照图谱，多点校正将谱峰进行比较，得到相似度结果，查看样品的相关性。
　　根据各色谱峰与标准单糖的保留时间对照，可知百合多糖水解物液相色谱图中各峰代表的单糖分别为鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、葡萄糖、半乳糖（图１），采用面积归一化方法计算单糖的含量，结果见表１。
　　３ 讨论
　　ＰＭＰ与糖类物质衍生时反应条件温和，产物无立体异构。２分子ＰＭＰ与１分子单糖缩合生成的衍生物与各单糖的定量关系明确，线性关系良好。检测灵敏度较高，可同时检测醛糖、酮糖及糖醛酸；ＰＭＰ衍生物在２５４ ｎｍ处有强烈的紫外吸收，克服了单糖本身没有紫外吸收峰的缺点，同时使用紫外检测器克服了示差检测器灵敏度低、不适用于梯度洗脱的缺点。本试验中采用ＰＭＰ衍生物液相色谱法进行百合多糖组成分析，其衍生物制备简便、试剂易得，且每种单糖均可得到单一色谱峰。分析结果表明百合多糖主要由鼠李糖、阿拉伯糖、葡萄糖、木糖、半乳糖５种单糖组成，其含量分别为４．８２％、１２．７９％、４７．０２％、１３．０１％、２２．３６％。
　　参考文献：
　　［１］ 田爱梅，郑日如，王国强，等． 中国野生百合种质资源的研究、保护与利用［Ｊ］． 安徽农业科学，２００７，３５（３１）：９９８７－９９９０．
　　［２］ 王 燕． 我国百合产业现状及其发展对策［Ｊ］．湖南农业科学，２００７（５）：１５０－１５２，１５６．
　　［３］ 赵国华，李志孝，陈宗道．百合多糖的化学结构及抗肿瘤活性［Ｊ］． 食品与生物技术，２００２，２１（１）：６２－６６．
　　［４］ 刘成梅，付桂明，涂宗才，等． 百合多糖降血糖功能研究［Ｊ］．食品科学，２００２，２３（６）：１１３－１１４．
　　［５］ 姜 茹，匡永清，吴少华．百合免疫活性多糖的分离及其组成［Ｊ］．第四军医大学学报，１９９８，１９（２）：１８８．
　　［６］ 张惟杰．复合多糖生化研究技术［Ｍ］． 杭州：浙江大学出版社，１９９９．３８－４０．