线粒体全基因组测序 龟鳖类线粒体全基因组的比较研究

　　摘　要：在基因组水平上，比较分析了已登录GcnBank的19种龟鳖类线粒体全基因组的结构特征，结果表明：1)除平胸龟、扁陆龟外，其余17种龟鳖类线粒体基因组结构、基因排列顺序均与典型的脊椎动物相似，显示龟鳖类线粒体基因组在进化上十分保守：2)19种龟鳖类线粒体全基因组和各部分的碱基组成均表现出高AT、低G含量的偏向，在控制区中表现尤为明显：3)除中华鳖和白腹摄龟外，其余种类的某些蛋白编码基因中都存在一个或多个额外插入的核苷酸：4)除侧颈龟亚目的非洲侧颈龟外，其余18种曲颈龟线粒体DNA的“wANCY”区中都存在轻链复制起始点(OL)，且它们的二级结构、核苷酸组成高度保守，推测该结构可能是曲颈龟亚目的一个共同特征：5)部分龟鳖类线粒体基围组控制区3′端存在大片段(200～450bp)的重复序列，某些龟鳖类中有由(AT)构成的微卫星序列，并且这些拷贝序列在种间表现出一定的差异，其可作为特异的分子标记，对于龟鳖类动物系统学的研究、亲缘关系的鉴定、物种多样性的保护和研究等方面具有重要的参考价值。
　　关键词：19种龟鳖类；线粒体全基因组；基因组结构；控制区；串联重复序列
　　中图分类号：Q959.6　文献标识码：A　文章编号：1007－7847(2007)03－0258－05
　　
　　龟鳖类出现在距今约2亿多年前的二叠纪至三叠纪期间，是地球上最特化、最古老的一支爬行动物，享有“活化石”的美誉，在脊椎动物的系统演化史上具有重要的地位，据统计，全世界现存龟鳖类动物约有13科、89属、270余种，被分为两个特征明确的支系――侧颈龟亚目和曲颈龟亚目，由于自然或人为的生存环境的破坏以及人类的食物和医药利用等因素，使现有的龟鳖类物种面临严重的危胁，野生数量日趋枯竭：而龟鳖类动物属于长寿、晚熟、繁殖率低的类群，因此，为了保护野生动物并持续利用龟鳖资源，加强对龟鳖类动物的研究很有必要。
　　脊椎动物线粒体基因组是共价闭合的双链DNA，大小约15～20kb，由于具有结构简单、很少受到序列重排的影响、呈母系遗传等特点，近年来线粒体基因组DNA(mtDNA)成为研究动物进化和系统发育的重要分子材料，同样受到愈来愈多的龟鳖类动物系统学研究者的青睐，至2007年4月，GenBank中公开发表的龟鳖动物线粒体基因组全序列共有17种，在这17种中，侧颈龟类仅非洲侧颈龟(Pelomedusa subrufa)1种，曲颈龟类16种，其中包括：陆龟科(Testudinidae)10种，鳖科(Trionychidae)2种，淡水龟科(Geoemydidae)、龟科(Emydidae)、海龟科(Cheloniidae)、平胸龟科(Platysternidae)各1种。
　　本文拟对这17种龟鳖类结合我们近期测定的锯缘摄龟(Pyxidea mouhotii)和白腹摄龟(Cy-clemys atripons)的mtDNA全序列(另文待发表)共19种龟鳖类，在基因组水平上进行了比较研究，以期探讨龟鳖类动物线粒体的基本特征。
　　
　　1　19种龟鳖类动物的线粒体基因组比较分析
　　
　　1．1　基因组结构和基因排布
　　已测定19种龟鳖类动物的线粒体基因组全长在16455～19438bp之间，其中最长的是缘翘陆龟Testudo marginata，其次是平胸龟Platyster-non megacephalum，最短的是黑凹甲陆龟Manouria emys，除平胸龟和扁陆龟有两个控制区和其它一些特异性外，其余17种龟鳖类的线粒体基因组结构和基因排列顺序均与典型脊椎动物的相似，包括13个蛋白质编码基因、22个tR-NA基因、2个rRNA基因和1个非编码基因控制区(control region)(详见图1)。
　　
　　多数龟鳖类线粒体基因组的基因排布较为紧凑，但一些物种中也存在特异的间隔序列：中国平胸龟mtDNA中存在3段大于150bp的基因间隔区：非洲侧颈龟中ND5和ND6基因间间隔124bp；锯缘摄龟和白腹摄龟中ND4和tRNAX~基因间间隔分别为13bp、12bp，此外，类似于典型脊椎动物，多数龟鳖类线粒体基因组中，ATP8/ATP6，ND4L/ND4和ND5/ND6基因间分别有10bp、7bp和5bp的序列重叠，非洲侧颈龟和锦龟中ATP8／ATP6基因则重叠31bp。
　　
　　1．2　碱基组成
　　19种龟鳖类动物的线粒体全基因组、13个蛋白编码基因、2个rRNA基因、22个tRNA基因和控制区的部分碱基组成见表1，比较发现：这19种动物的碱基组成相似；4种碱基中G含量最少，A+T含量相对较高，而且在控制区中这种偏向表现尤为明显，这种现象与鸟类等脊椎动物类似：在核苷酸组成上偏好于AT编码。
　　
　　1．3　编码蛋白基因
　　19种龟鳖类线粒体基因组中，除非洲侧颈龟有一个推测的ND4L基因外，其余的均可确定有13个编码蛋白基因，且序列长度较为保守，13个编码蛋白基因的起始密码子可分为3类：编码甲硫氨酸(Met)的ATR：ATG和ATA，编码异亮氨酸(Ile)的ATC和编码缬氨酸(Val)的GTG，共4种，其中ATG使用频率最高，GTG为多数龟鳖类COI基因的起始密码子；终止密码子也可分为3类：AGR(AGG和AGA)，TAR(TAG和TAA)和不完全的T或TA，共6种，其中最常用的是TAA，不完全终止子(T或TA)在后生动物线粒体基因组中很常见，推测可由转录后3′端“A”补齐转化为完全的终止子TAA，此外，类似于鸟类等脊椎动物，龟鳖类线粒体基因组的密码子使用基本符合“摆动学说”，在密码子第3位点上变异较大，而且在碱基的选择上更趋向于“A”。
　　中国平胸龟不仅在ND3基因的174位点存在一个额外插入的胞苷酸(C)，且NDl基因中3个不同位点各存在一个插入的核苷酸(2个腺苷酸“A”和1个胸苷酸“T”)；非洲侧颈龟除ND3基因有一个额外插入的腺苷酸(A)外，在推测的ND4L基因的两个不同位点也分别插入了一个腺苷酸(A)和一个胸苷酸(T)；其余多数龟鳖类mtDNA仅ND3基因的第174位点存在一个额外插入的腺苷酸(A)，一般认为，这些额外插入的单核苷酸在翻译过程中不表达，可能通过RNA编辑来恢复基因的功能，从而避免移码突变导致基因转译提前终止，此外，通过分析目前的19种龟鳖类mtDNA序列发现，这种核苷酸插入形成终止移码框的现象在中华鳖和白腹摄龟中不存在，因此，这种现象是否是龟鳖类的一个共同特征，还是具有一定的种属特异性，以及具体的形成机制和作用，尚有待于进一步的研究。
　　
　　1．4　轻链复制起始点(OL)
　　除侧颈龟亚目的非洲侧颈龟外，已测的所有曲颈龟亚目mtDNA的tRNATrp-tRNAAla-tRNAaAsn- tRNACys-tRNATyr(WANCY)基因簇区的tRNAAAsn和tRNACys之间都包含一个典型的“茎一环”(stem-loop)结构，此结构在蛇类、鱼类和两栖类等很多脊椎动物中也有报导，这个区域被认为是L链的复制起点OL(the origin ofliCht-strand replica-tion)，图2给出目前已测mtDNA全序列的曲颈龟6个科(每科选取一个代表物种)OL的二级结构，通过比较分析已知曲颈龟亚目mtDNA的OL序列发现，它们的二级结构高度相似，核苷酸组成高度保守，进一步地，其OL中茎上存在9bp的序列完全相同，由此推测，该结构可能是曲颈龟类的一个共同特征，但能否作为曲颈龟亚目和侧颈龟亚目的分类依据，尚需更多的龟鳖类线粒体基因组的测序研究。
　　
　　1．5　控制区序列
　　动物mtDNA可分为编码区和非编码区，非编码区即主要为线粒体基因组的控制区(control re-gion)或称D-Loop区，它是mtDNA复制与转录的关键部位，对mtDNA复制和转录起调控作用，同时是mtDNA基因组中序列和长度变异最大、进化速率最高、最具多态的区域，控制区的这种变异在进化上相对保守的龟鳖类动物中也得到很好的体现，已测19种龟鳖mtDNA全序列中，除扁陆龟、平胸龟出现控制区双拷贝外，其余的皆为单拷贝控制区，其中最长的是缘翘陆龟3943bp，最短的为黑凹甲陆龟948bp，长度变异较大，控制区长度差异是造成线粒体全基因组长度差异的主要原因。
　　控制区长度和序列组成在脊椎动物各类群即便是亲缘关系较近的物种中变异也较大，如：目前已测mtDNA全序列的3种亲缘关系较近的淡水龟：乌龟、锯缘摄龟和白腹摄龟，其控制区长度在981～1316bp之间，依据碱基组成和变异程度，可以将其划分为3个区：domainⅠ～Ⅲ，其中domainⅡ区(中央保守区)序列相对保守，位于F-box和CSBl间，而domainⅠ和domainⅢ区碱基变异程度较大，为遗传上的高变区，此外，脊椎动物3个短的保守区(CSBO1～3)在3种淡水龟控制区的domainⅢ中也存在，3种淡水龟控制区序列差异最为显著的是domainⅢ区的3′端含有大量的串联重复序列，包括仅由A和T构成的短序列的拷贝，具体表现为：在乌龟中存在(ATATATC)7bp单元间隔重复14次，且3′端紧接(AT)％8微卫星序列；锯缘摄龟中为(ATTATATC)8bp的单元直接重复36次。而且紧邻3’端为(AITATATr)8bp的单元间隔重复13次；白腹摄龟中仅有[A(AT)3]单元直接重复15次的微卫星序列。前面没有其它的重复序列拷贝，3种淡水龟控制区3′端的重复拷贝序列，特别是由AT构成的微卫星序列拷贝也出现于其它的一些龟鳖类线粒体基因组中，Zardoya和Meyer(1998)曾报道在非洲侧颈龟控制区3′端存在453bp长的重复序列，由6个直接拷贝序列构成且每个拷贝序列3′端紧接(TA)10-11微卫星序列，最为特殊的是3，端邻接tRNAphe基因的微卫星序列较长：由7个TAA(TA)3-4单元构成，此外，通过比较分析，我们发现控制区3′端大片段的重复拷贝序列(200～450bp)，包括由AT构成的微卫星DNA序列，除在已知的非洲侧颈龟和3种淡水龟中存在外，在马来亚鳖、锦龟、绿海龟中表现也较为明显，但是，不同的物种中重复单元的核苷酸组成和重复次数不同，这些可作为特异的分子标记，对于龟鳖类动物系统学的研究、亲缘关系的鉴定、物种多样性的保护和研究等方面具有重要的参考价值。
　　
　　2　龟鳖类mtDNA的研究展望
　　
　　目前，绝大多数龟鳖类动物mtDNA全序列尚未测定，已测的还不到物种总数的10％，这对于精确的龟鳖类系统学研究显然是有限的，mtD-NA研究已逐渐转向大批量的测定全序列及其与核DNA结合共同研究物种的系统进化。
　　龟鳖类动物mtDNA控制区中发现大量的串联重复序列，且在种间表现出一定的差异，以此为基础研究龟鳖类的线粒体异质性和mtDNA复制、转录以及动物特异的分子标记等，此外，有些龟鳖类，特别是一些杂交种，如：锯齿黄额闭壳龟(Cuora serrata)、缺颚花龟(Ocadia glyphistoma)、菲律宾花龟(Ocadia philippeni)、艾氏拟水龟(Mauremys iversoni)、腊戌拟水龟(Mauremyspritchardi)，其产生机理和分类地位尚未清楚，这些都有待于进一步的研究。
　　
　　作者简介：张莉(1979－)，女，安徽蒙城人，硕士研究生，主要从事动物细胞与分子生物学研究；
　　聂刘旺(1962－)，男，安徽潜山人，安徽师范大学教授，博士，通讯作者，主要从事动物遗传与分子生物学研究。