基因编辑技术研究进展 [紫花苜蓿耐逆转基因研究进展]

　　摘要：本文综述了苜蓿抗寒、抗旱、耐盐碱、耐酸铝等耐逆转基因方面的国内外研究进展，并就苜蓿转基因工程研究的发展方向做了展望，旨在为紫花苜蓿耐逆育种提供参考。　　关键词：紫花苜蓿；耐逆；转基因
　　通过基因工程的方法提高作物的抗性是近年来研究的热点，自1986年首例农杆菌介导的转基因苜蓿获得成功，紫花苜蓿耐逆转基因方面已取得突破性进展，对植株的耐逆性有了较大的提升。利用转基因技术育种手段，针对性地开展耐逆紫花苜蓿研究，有利于丰富我国苜蓿的品种资源，推动南方苜蓿产业化发展。本文综述该方面的研究进展，旨在为紫花苜蓿的耐逆育种提供重要参考。
　　1、抗旱耐寒转基因
　　在干旱和冷害条件下，植物细胞中会积累大量活性氧，导致蛋白质、膜质、DNA及其它细胞组分严重损伤，紫花苜蓿植株内的各种酶促和非酶促抗氧化系统可有效清除活性氧。超氧化物歧化酶(SOD)是抗氧化胁迫防御体系的重要成分，SOD是目前通过转基因方法提高植物抗寒、抗旱性研究最为积极的对象。目前已经克隆受干旱胁迫诱导的超氧化物歧化酶、过氧化氢酶基因。将烟草的Mn-SOD酶表达于苜蓿，使苜蓿抗旱性提高。在转基因紫花苜蓿中，叶绿体SOD的过量表达，提高了对氧化胁迫的耐受性；SOD在苜蓿线粒体中的过量表达也具有相同的效果，转基因苜蓿Chl SOD的过量表达提高了对冻害的耐受性。Zhang等将转录因子(AP2)的cDNA(WXP1)置于35S启动子下转化苜蓿，结果表明：转基因苜蓿叶片表面的表皮蜡层增厚，减少水分散失，抗旱能力增强。Jiang Q采用CER6启动子在苜蓿中超表达WXP1基因，转基因植株抗旱能力提高，并且发现该基因还与光合作用有关。
　　Mckersie等将烟草Mn-SOD的cDNA与CaMV35S启动子构建了pMistSOD和pChslSOD的2个质粒载体，分别转化紫花苜蓿，结果发现：低温胁迫对转基因植株生长的抑制明显减轻，但线粒体和叶绿体定位的Mn-SOD转基因植株间耐逆性差异不显著。经2个冬季试验，发现转基因紫花苜蓿的越冬成活率高于未转化植株，产量提高25%，转基因植株叶片和根中的SOD酶活性显著增加。Mckersie等将拟南芥Fe-SOD基因转入紫花苜蓿，试验表明， Fe-SOD基因的超表达降低了低温对植物的次级伤害，从而提高了其恢复能力。韩利芳等将烟草Mn-SOD基因的cDNA序列导入保定苜蓿，诱导了转基因植株的再生，MnSOD活性检测表明，部分转基因植株的Mn-SOD活性显著提高。Shearer等将修饰过的SPS（蔗糖磷酸合成酶）基因结合35S启动子导入紫花苜蓿，试验证实了转基因植株的耐寒性增加。
　　2、耐盐碱转基因
　　在紫花苜蓿耐盐转基因方面，Wincov和 Winicov先后将Alfinl基因导入紫花苜蓿中，发现转录因子Alfin1在紫花苜蓿中的过量表达，不仅提高了紫花苜蓿根中特异内源基因MsPRP2的积累水平，而且转基因植株的耐盐性也显著提高。苏金等比较了3个转Alfin1基因紫花苜蓿植株在盐胁迫条件下的生长特性，结果显示转基因植株的生长量是受体对照植株的2～3倍，证实了Alfinl的超量表达能增强转基因紫花苜蓿的氯化钠抗性。晏石娟等对导入果聚糖合成酶基因的紫花苜蓿进行耐盐生长适应性的研究，发现转化苗比对照苗耐受盐胁迫的能力要高，在盐胁迫下，转化苗的根生长能力要强于对照苗，表明转基因紫花苜蓿的抗性比对照耐盐能力强。
　　胚胎发育晚期丰富蛋白 (1ate embryogenesis abundant, LEA)是目前植物逆境生物学研究中受高度关注的抗胁迫功能蛋白质，具有很高的亲水性和热稳定性，lea基因的表达量与植物抗旱耐盐能力呈正相关。王瑛等利用基因枪法将来源于大麦的lea3基因导入紫花苜蓿品种“中苜一号”，获得转基因植株在高盐胁迫下具有较高的存活率，耐盐能力约是原品种的4倍，表明转lea3基因可用于苜蓿抗旱耐盐育种。肖荷霞等以苜蓿(Medicago sativa)品种中苜一号为试材，进行愈伤组织诱导。通过基因枪法将来源于大麦的胚胎发生丰富蛋白基因lea3导入愈伤组织细胞，于8 mg／L PPT的选择压力下筛选2个月，获得抗性愈伤组织及再生植株，将再生植株再次转入含有PPT的诱导继代培养基中筛选。经PCR检测，2l株再生植株中有2株扩增出了目的基因片段。证明lea3基因已导入了苜蓿细胞中。
　　杨金慧等选用公农1号紫花苜蓿，以5～7d苗龄的无菌子叶为外植体，通过农杆菌介导法将含有甜菜碱醛脱氢酶(BADH)和酸性蛋白酶(pepB)双价基因的无选择标记表达载体导入苜蓿子叶中，并用含有Na2CO3和NaHCO3碱性盐溶液的培养基进行筛选，得到抗盐碱转化植株。刘艳芝等用根癌农杆菌介导法将克隆于酵母的HAL1基因转化龙牧803苜蓿胚性愈伤组织，培养基耐盐性实验结果初步证明，HAL1基因已在龙牧803苜蓿中表达，并提高了耐盐性。
　　3、耐酸铝转基因
　　紫花苜蓿对土壤铝毒极为敏感，铝离子主要抑制紫花苜蓿根系的生长，从而使其严重减产。近年来研究表明，通过转化一些有机酸合成的相关基因可提高紫花苜蓿的耐铝性。
　　苹果酸是一种有效游离铝离子鳌合剂，由草酸乙酸经苹果酸脱氢酶(Malate Dehydorgenase, MDH)催化形成。Tesfafe等将苜蓿根瘤苹果酸脱氢酶基因(neMDH)转入紫花苜蓿，发现转基因植株中柠檬酸、草酸、苹果酸、琥珀酸和乙酸的含量均有所增加，对铝的耐受性也相应增强，转基因植株根系中柠檬酸、草酸、苹果酸、琥珀酸和乙酸含量是对照的4.2倍；将转基因植株在石英砂中培养时，其根部分泌的柠檬酸、草酸、苹果酸、琥珀酸和乙酸是对照的7.1倍；在20μmol/L的AlCl3中，转基因植株根系的长度是对照的2-3倍，在100μmol/L的AlCl3中，对照植株己停止生长，但转基因植株的根仍然正常生长。罗小英等将根瘤苹果酸脱氢酶基因neMDH基因转入紫花苜蓿，发现在铝胁迫下，转基因株系根相对伸长量比对照高出3.6%～22.5%，说明超量表达neMDH基因提高了转基因紫花苜蓿对铝毒的耐受性。