[冻虾仁中一株发酵阿拉伯糖的溶藻弧菌的分离鉴定] 溶藻弧菌
摘要：在对一份冻虾仁样品的检测过程中分离到一株弧菌，经过形态观察、自动生化测试和手工生化测试，最终鉴定为发酵阿拉伯糖的特殊生化型溶藻弧菌。叙述了检测、分离和鉴定的过程，并对弧菌鉴定的方法选择和弧菌病的防治作了探讨。
关键词：冻虾仁；溶藻弧菌；阿拉伯糖；分离鉴定
中图分类号：Ｑ９３９．１ 文献标识码：Ａ 文章编号：0439－８114（２０12）16－3479-04
Isolation and Identification of a Vibrio alginolyticus Strain Fermenting Arabinose from Frozen Shrimp
ＣＨＥＮ Ｗｅｉ－fｅｎｇ１，ＺＨＵ Ｌｕ２，ＨＯＮＧ Ｓｈｕ－yｉｎ１，ＺＨＡＯ Ｘｉｕ－lｉｎｇ１
（１． Ｆｅｎｇｈｕａ Eｎｔｒｙ－ｅｘｉｔ Iｎｓｐｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Qｕａｒａｎｔｉｎｅ Bｕｒｅａｕ，Ｆｅｎｇｈｕａ ３１５５００，Ｚｈｅｊｉａｎｇ，Ｃｈｉｎａ；
２．Ｚｈｅｊｉａｎｇ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ， Ｎｉｎｇｂｏ ３１５０２０， Ｚｈｅｊｉａｎｇ，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ａ Ｖｉｂｒｉｏ ｓｔｒａｉｎ ｗａｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｆｒｏｚｅｎ ｓｈｒｉｍｐ ａｎｄ ｕｌｔｉｍａｔｅｌｙ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ａｓ ａ ｒａｒｅ Ｖｉｂｒｉｏ ａｌｇｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ ｓｔｒａｉｎ ｆｅｒｍｅｎｔｉｎｇ ａｒａｂｉｎｏｓｅ ｔｈｒｏｕｇｈ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ ａｎｄ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｔｅｓｔｓ． Ｔｈｅ ｐｒｏｃｅｓｓ ｏｆ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ， ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｗａｓ ｄｅｓｃｒｉｂｅｄ， ａｎｄ ｔｈｅ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｖｉｂｒｉｏ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ Ｖｉｂｒｉｏ ｄｉｓｅａｓｅ ｗａｓ ｄｉｓｃｕｓｓｅｄ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｆｒｏｚｅｎ ｓｈｒｉｍｐ； Ｖｉｂｒｉｏ ａｌｇｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ； ａｒａｂｉｎｏｓｅ； ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ
溶藻弧菌（Ｖｉｂｒｉｏ ａｌｇｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ）是１２种人类致病性弧菌之一，专性嗜盐，广泛分布于海洋和江河入海口的水域中，数量居海水类弧菌之首。该菌最初被划分为副溶血性弧菌的生物Ⅱ型，后来根据基因组同源性分析结果将其划为一个独立的种［１］。溶藻弧菌是水产养殖，特别是海水养殖中重大流行病的引发源之一，可引起鱼类溃疡病、虾类红腿病、白斑病等［２］。该菌也是人类的条件致病菌，可引起人类食物中毒［３］、伤口感染［４］、筋膜炎［５］等疾病。林业杰等［６］的研究发现有5.0％的溶藻弧菌检出ＳＴ肠毒素、２０.0％的溶藻弧菌检出ＬＴ肠毒素、８８．１％的溶藻弧菌菌株能产生溶血素，因而认为该种细菌可能含有多种致病因子，应当与副溶血性弧菌同等重视。
通过菌落形态观察、嗜盐性试验、糖发酵试验和其他生化试验，可以将溶藻弧菌和副溶血性弧菌、霍乱弧菌等常见致病性弧菌区分开来。对一份冻虾仁样品检测过程中分离到的一株弧菌经过形态观察、自动生化测试和手工生化测试，最终鉴定为发酵阿拉伯糖的溶藻弧菌菌株，是一种罕见的生化型，同时对弧菌鉴定的方法选择和弧菌病的防治作了探讨。
１ 材料与方法
１．１ 材料
出口企业送检的冻虾仁样品。
１．２ 主要试剂
缓冲蛋白胨水、四硫磺酸钠煌绿增菌液（ＴＴＢ）、亚硒酸盐胱氨酸增菌液（ＳＣ）、亚硫酸铋琼脂（ＢＳ）、Ｈｅｋｔｏｅｎ Ｅｎｔｅｒｉｃ琼脂（ＨＥ）、硫代硫酸盐－柠檬酸盐－胆盐－蔗糖琼脂（ＴＣＢＳ）、微量生化管均为北京陆桥技术有限责任公司产品；ＧＮＩ＋革兰氏阴性菌测试卡及配套试剂、ＡＰＩ ２０Ｅ（肠杆菌等革兰氏阴性菌测试条）均为法国生物梅里埃公司产品；弧菌显色培养基（法国科玛嘉）。
１．３ 试验方法
１．３．１ 增菌培养和菌株分离 按《食品安全国家标准 食品微生物学检验 沙门氏菌检验》（ＧＢ ４７８９．４－２０１０）［７］对样品进行检测。取２５ ｇ样品加入到２２５ ｍＬ缓冲蛋白胨水中，充分均质后３６．０ ℃培养１８ ｈ。分别取１ ｍＬ培养液转接至１０ ｍＬ ＴＴＢ和１０ ｍＬ ＳＣ中，增菌培养２４ ｈ后划线接种至ＢＳ和ＨＥ平板。
１．３．２ 挑取可疑菌落与自动生化鉴定 挑取可疑菌落，接种于三糖铁斜面上，并用营养琼脂平板纯化，菌株编号为５４１２－１。纯化菌株进行革兰氏染色镜检，按ＧＢ ４７８９．４－２０１０进行赖氨酸脱羧酶、靛基质、尿素酶和氰化钾试验。测定氧化酶活性，按ＧＮＩ＋革兰氏阴性菌测试卡使用说明进行自动生化测试，测试设备为ＶＩＴＥＫ ３２微生物分析系统。
１．３．３ 弧菌选择性培养基观察与微量生化测试 根据自动生化测试结果，初步判断５４１２－１菌株为弧菌属细菌。将该菌株接种到ＴＣＢＳ和弧菌显色培养基中，观察菌落形态。参照ＧＢ／Ｔ ４７８９．７－２００８《食品微生物学检验 副溶血性弧菌检验》［８］和《伯杰氏系统细菌学手册》［１］关于弧菌属内常见菌株的生化特征的描述，对５４１２－１菌株的耐盐生长能力和主要生化指标进行了进一步研究。
１．３．４ ＡＰＩ ２０Ｅ确认试验 新鲜培养的菌落加入到５ ｍＬ ０．８５％ＮａＣｌ培养液中制成１．０麦氏浓度的菌悬液。按要求将菌悬液加入到ＡＰＩ ２０Ｅ试剂条的测试孔中，培养过夜观察结果。
２ 结果与分析
２．１ 平板分离与初步鉴定结果
在对一份冻虾仁样品进行沙门氏菌项目的检测过程中，在ＨＥ平板上发现蓝绿色圆形的菌落（图１a），挑取典型菌落纯化，编号为５４１２－１。该菌株经染色观察，为革兰氏阴性杆菌。按照ＧＢ ４７８９．４－２０１０测定其生化特征，结果为不产Ｈ２Ｓ，尿素酶、赖氨酸脱羧酶、靛基质和氰化钾试验均为阴性。使用ＧＮＩ＋革兰氏阴性菌鉴定卡进行自动生化测试（用０．４５％ ＮａＣｌ溶液作稀释液），结论为５０％溶藻弧菌／４９％副溶血性弧菌。以上结果排除了５４１２－１是沙门氏菌的可能，并提示该菌株很可能是弧菌。因此使用０．８５％ ＮａＣｌ溶液作稀释液再次进行自动生化测试，结果见表1。测试结论为６６％副溶血性弧菌／１７％溶藻弧菌，尚无法得到可接受的鉴定结果，需用其他方法进一步鉴定。