不溶性草酸氧化酶的部分纯化研究|草酸降解酶

　　摘要：以大麦麦麸为原料，对不溶性草酸氧化酶进行了部分纯化，比较了酶法与滴定法测定草酸的方法。结果表明，粗酶经酸热变性、淀粉酶水解、ＮａＣｌ洗涤、去离子水洗涤４个步骤的纯化后，不溶性草酸氧化酶的纯化倍数为１．５１；酶法与滴定法测定草酸无显著性差异。该技术有望用于草酸检测试剂盒的开发。
　　关键词：麦麸；不溶性草酸氧化酶；部分纯化
　　中图分类号：Ｑ８１４．９文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０11）14－2943-02
　　
　　Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｎ Ｐａｒｔｉａｌ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｕｎｓｏｌｕｂｌｅ Ｏｘａｌａｔｅ Ｏｘｉｄａｓｅ
　　
　　ＺＨＡＮＧ Ｍｅｎｇ－ｃｈｅｎｇ，ＸＵ Ｃｈｕｎ－ｈｕｉ，ＨＵ Ｙｉ－ｈｏｎｇ
　　（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｈｕｎａｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｕｍａｎｉｔｉｅｓ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｌｏｕｄｉ ４１７０００， Ｈｕｎａｎ，Ｃｈｉｎａ）
　　
　　Ａｂｓｔｒａｃｔ： Tｈｅ ｐａｒｔｉａｌ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｕｎｓｏｌｕｂｌｅ ｏｘａｌａｔｅ ｏｘｉｄａｓｅ ｆｒｏｍ ｂａｒｌｅｙ ｂｒａｎ was explored. And ｔｈｅ ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ ｍｅｔｈｏｄ ｕｓｉｎｇ ｕｎｓｏｌｕｂｌｅ ｏｘｉｄａｓｅ ａｎｄ ｔｈｅ ｔｉｔｒａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ for ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｔｈｅ ｏｘａｌｉｃ ａｃｉｄ ｃｏｎｔｅｎｔ was compared． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｅｎｚｙｍｅ ｗａｓ ｐｕｒｉｆｉｅｄ １．５１－ｆｏｌｄ after ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ ｔｈｅｒｍａｌ ａｎｄ ａｃｉｄ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ， ｈｙｄｒｏｌｙｚｉｎｇ ｗｉｔｈ ａｍｙｌａｓｅ， ｗａｓｈｉｎｇ ｗｉｔｈ ＮａＣｌ ａｎｄ ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ ｗａｔｅｒ． Ｎｏ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｗａｓ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ ｔｈｅ ｔｉｔｒａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｗｈｅａｔ ｏｘａｌｉｃ ａｃｉｄ． Ｔｈｉｓ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｃould ｂｅ ｕｓｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ ｏｆ ｏｘａｌａｔｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｋｉｔ．
　　Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｂａｒｌｅｙ ｂｒａｎ； ｕｎｓｏｌｕｂｌｅ ｏｘａｌａｔｅ ｏｘｉｄａｓｅ； ｐａｒｔｉａｌ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ
　　
　　草酸检测广泛应用于食品、养殖等行业对原料的质量鉴定，常采用色谱法、滴定法和酶法。其中酶法检测最为快捷，成本低，应用前景广阔［１，2］。酶法检测通常采用草酸氧化酶（Ｏｘａｌａｔｅ ｏｘｉｄａｓｅ，ＯｘＯ）与ＰＯＤ偶联，检测草酸氧化产生的Ｈ２Ｏ２的量以确定草酸含量。该试验采用市售大麦麸皮为原料，对不溶性ＯｘＯ进行部分纯化，旨在建立低成本制备ＯｘＯ的方法，达到廉价、快速测定草酸的目的。
　　１材料与方法
　　１．１材料
　　市售大麦麸皮；小麦品种烟优３６１，青岛农业大学提供；４－氨基氨替吡啉，Ｓｉｇｍａ公司；其他试剂均为国产分析纯。
　　１．２方法
　　１．２．１不溶性ＯｘＯ的部分纯化磨碎大麦麸皮，经２００目过筛，称取过筛物５０ ｇ，加入等体积的０．１ ｍｏｌ／Ｌ ｐＨ值为３．８的琥珀酸溶液，７０ ℃水浴１５ ｍｉｎ。5 000 g离心５ ｍｉｎ，去除析出的黏稠物，５０ ℃烘干，加入等体积０．１ ｍｏｌ／Ｌ ｐＨ值为６．８的磷酸缓冲液、２ ｇ淀粉酶，３７ ℃保温１ ｈ，离心收集沉淀；加入等体积的１ ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ溶液３０ ℃保温１ ｈ，同样方法离心收集沉淀。去离子水淋洗３次，离心收集沉淀，５０ ℃烘干沉淀，研磨后经２００目过筛，过筛物即为部分纯化的不溶性ＯｘＯ，置于干燥皿中备用。
　　1.2.2测定方法
　　1）ＯｘＯ活性测定。参照刘娥娥等［３］的方法，１ ｍＬ反应体系中含４－氨基氨替吡啉０．４ ｍｇ，５ Ｕ ＰＯＤ，６ ｍｇ琥珀酸，０．２５ μＬ Ｎ，Ｎ－二甲基苯胺，７５％乙醇，用ＮａＯＨ调整ｐＨ值至３．８，加入５０ ｍｇ不溶性ＯｘＯ，以０．５ ｍｍｏｌ／Ｌ的草酸启动反应，不加草酸的反应体系为空白，测定３０ ｍｉｎ后的ＯＤ５５５。以室温下每分钟产生１ μｍｏｌ Ｈ２Ｏ２为１ Ｕ。
　　 2）Ｈ２Ｏ２生成检测。采用显色液检测ＯｘＯ在无草酸条件下是否有红色物质生成。
　　 3）ＰＯＤ、ＣＡＴ活性测定。采用张龙翔等［４］的方法测定。
　　 4）不溶性糖测定。参照胡居吾等［５］的方法，用２ ｍＬ １０％的硫酸溶解０．１ ｇ不溶性ＯｘＯ，去离子水定容至５００ ｍＬ，取１ ｍＬ置于试管中，加入１ ｍＬ ２％的苯酚、５ ｍＬ浓硫酸，３０ ｍｉｎ后检测ＯＤ４９０。标准曲线采用葡萄糖制备。
　　 5）草酸测定。酶法测定草酸，采用Ｌｉｕ等［２］的方法。滴定法测定草酸，采用Ｂａｋｅｒ［６］的方法。
　　２结果与分析
　　２．１不溶性ＯｘＯ的部分纯化
　　经２００目过筛的粗酶经酸热变性、淀粉酶水解、ＮａＣｌ洗涤、去离子水洗涤４个步骤的纯化结果见表１。不溶性ＯｘＯ是一类耐高温的多聚糖蛋白，分析不溶性总糖含量，最终纯化倍数为１．５１。
　　３讨论
　　ＯｘＯ是快速检测草酸的工具酶，有学者曾尝试用可溶性ＯｘＯ与不溶性ＯｘＯ共同参与反应，或直接用不溶性ＯｘＯ测定草酸含量，说明不溶性ＯｘＯ能作为酶法测定草酸的工具酶。同时，以不溶性ＯｘＯ作为工具酶参与反应，更加接近ＯｘＯ在自然生理条件下的状况，可靠性更高。
　　大麦麦麸中的不溶性ＯｘＯ活性高，是热稳定的糖蛋白，适合作为不溶性ＯｘＯ大量制备的廉价原料。经过酸热变性、淀粉酶水解、ＮａＣｌ洗涤等步骤的纯化，纯化倍数达到1.51，排除了麦麸中对Ｈ２Ｏ２显色的干扰物质，适合作为草酸测定的工具酶使用。我们采用从大麦麦麸中提取不溶性的ＯｘＯ，克服了上述缺点。这一方法有望为研制有自主产权的草酸测定试剂盒提供技术参考。
　　
　　参考文献：
　　［１］ 胡一鸿，李向阳，莫亿伟． 植物草酸氧化酶［Ｊ］． 生命的化学，２００９，２９（２）：２９５－２９７．
　　［２］ ＬＩＵ Ｅ Ｅ， ＬＯＵ Ｗ， ＺＨＯＵ Ｈ， ｅｔ ａｌ． Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｏｘａｌａｔｅ ｉｎ ｐｌａｎｔ ｔｉｓｓｕｅｓ ｗｉｔｈ ｏｘａｌａｔｅ ｏｘｉｄａｓｅ ｐｒｅｐａｒｅｄ ｆｒｏｍ ｗｈｅａｔ［Ｊ］． Ｂｉｏｌｏｇｉａｌ Ｐｌａｎｔａｒｕｍ，２００９，５３（１）：１２９－１３２．
　　［３］ 刘娥娥，郭振飞． 小麦萌发素Ｇ和ψＧ的纯化及其部分特性［Ｊ］． 植物生理与分子生物学学报，２００４，３０（４）：３９３－３９８．
　　［４］ 张龙翔，张庭芳，李令媛． 生物化学实验技术［Ｍ］． 第二版. 北京：高等教育出版社，２００２．
　　［５］ 胡居吾，范青生，肖小年． 粗多糖测定方法的研究［Ｊ］． 江西食品工业，２００５ （１）：１６－１８．
　　［６］ ＢＡＫＥＲ Ｃ Ｊ Ｌ． Ｔｈｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｏｘａｌａｔｅ ｉｎ ｆｒｅｓｈ ｐｌａｎｔ ｍａｔｅｒｉａｌ ［Ｊ］． Ａｎａｌｙｓｔ， １９５２， ７７：３４０－３４４．
　　
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