吊瓜的种类图片大全 利用RT-PCR技术检测吊瓜病毒种类的研究

　　摘要：小西葫芦黄花叶病毒（Ｚｕｃｃｈｉｎｉ ｙｅｌｌｏｗ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ，ＺＹＭＶ）、西瓜花叶病毒（Ｗａｔｅｒｍｅｌｏｎ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ，ＷＭＶ）、黄瓜花叶病毒（Ｃｕｃｕｍｂｅｒ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ，ＣＭＶ）、南瓜花叶病毒（Ｓｑｕａｓｈ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ，ＳｑＭＶ）和番木瓜环斑病毒（Ｐａｐａｙａ ｒｉｎｇｓｐｏｔ ｖｉｒｕｓ，ＰＲＳＶ）是危害葫芦科作物最严重、最广泛的５种病毒。根据已知的５种病毒序列设计特异性引物，对感染病毒的吊瓜总ＲＮＡ进行ＲＴ－ＰＣＲ扩增。结果表明长兴吊瓜的病毒种类主要为ＰＲＳＶ，感染率为１００％，无复合病毒感染。吊瓜植株不同取样部位（茎尖、卷须、嫩叶、茎、花、子房、老叶等）的ＲＴ－ＰＣＲ表明老叶是较好的病毒检测取样部位，而嫩叶是吊瓜脱毒最佳的外植体取样部位。对茎尖的ＰＲＳＶ表达量高过幼叶的原因也进行了分析，认为可能是病毒的表达量与植株的代谢强度有关。
　　关键词：吊瓜；ＲＴ－ＰＣＲ；病毒检测；病毒分布
　　中图分类号：Ｓ６４２ 文献标识码：Ａ 文章编号：0439－８114（２０11）09－1904-04
　　
　　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍａｉｎ Ｃａｕｓａｌ Ｖｉｒｕｓｅｓ in Ｔｒｉｃｈｏｓａｎｔｈｅｓ ｋｉｒｉｌｏｗｉｉ ｂｙ ＲＴ－ＰＣＲ
　　
　　ＸＵ Ｊｉｎｇ，ＷＡＮＧ Ｚｈｅｎ－ｈｕａ，ＰＡＮＧ Ｊｉ－ｌｉａｎｇ
　　（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｈａｎｇｚｈｏｕ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈａｎｇｚｈｏｕ ３１００３６，Ｃｈｉｎａ）
　　
　　Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｚｕｃｃｈｉｎｉ ｙｅｌｌｏｗ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ（ＺＹＭＶ）， Ｗａｔｅｒｍｅｌｏｎ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ（ＷＭＶ）， Ｃｕｃｕｍｂｅｒ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ （ＣＭＶ）， Ｓｑｕａｓｈ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ （ＳｑＭＶ） ａｎｄ Ｐａｐａｙａ ｒｉｎｇｓｐｏｔ ｖｉｒｕｓ （ＰＲＳＶ） ａｒｅ ｔｈｅ ｍｏｓｔ ｓｅｒｉｏｕｓ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ ｉｎｆｅｃｔｉｎｇ ｃｕｃｕｒｂｉｔａｃｅｏｕｓ ｃｒｏｐｓ． Ｆｉｖｅ ｐａｉｒｓ ｏｆ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｉｍｅｒｓ ｗｅｒｅ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ５ ｖｉｒｕｓｅｓ， ａｎｄ ＲＴ－ＰＣＲ ｗａｓ ａｐｐｌｉｅｄ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ｗｈｉｃｈ ｗａｓ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｆｒｏｍ Ｔｒｉｃｈｏｓａｎｔｈｅｓ ｋｉｒｉｌｏｗｉｉ Ｍａｘｉｍ． ｌｅａｖｅｓ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｖｉｒｕｓ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｃａｕｓａｌ ｖｉｒｕｓ ｏｆ Ｔ． ｋｉｒｉｌｏｗｉｉ ｉｎ Ｃｈａｎｇｘｉｎｇ ｗａｓ ＰＲＳＶ ｗｉｔｈ １００％ ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ ｒａｔｅ ａｓ ｎｏ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｗａｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ． Ｔｈｅ ＲＴ－ＰＣＲ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓａｍｐｌｉｎｇ ｐａｒｔｓ ｏｆ Ｔ． ｋｉｒｉｌｏｗｉｉ ｓｕｇｇｅｓｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｍｏｓｔ ｓｕｉｔａｂｌｅ ｐａｒｔ ｆｏｒ ｖｉｒｕｓ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｗａｓ ｏｌｄ ｌｅａｖｅ ａｎｄ ｔｈｅ ｍｏｓｔｖｉｒｕｓ－ｆｒｅｅ ｐａｒｔ ｗａｓ ｙｏｕｎｇ ｌｅａｖｅ． Ｔｈｅ ｃａｕｓｅ ｏｆ ｍｏｒｅ ＰＲＳＶ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ ｓｈｏｏｔ ｔｉｐ ｔｈａｎ ｉｎ ｙｏｕｎｇ ｌｅａｖｅｓ ｗａｓ ｄｉｓｃｕｓｓｅｄ， ａｎｄ ｉｔ ｗａｓ ｐｏｓｓｉｂｌｙ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｖｉｒｕｓ ｗａｓ ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ ｐｌａｎｔ＇ｓ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ．
　　Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｔｒｉｃｈｏｓａｎｔｈｅｓ ｋｉｒｉｌｏｗｉｉ Maxim.； ＲＴ－ＰＣＲ；ｖｉｒｕｓ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ； ｖｉｒｕｓ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ
　　吊瓜，学名栝楼（Ｔｒｉｃｈｏｓａｎｔｈｅｓ ｋｉｒｉｌｏｗｉｉ Ｍａｘｉm．），属葫芦科多年生蔓性藤本植物。其根、茎、叶、瓜皮、种子均可供药用，富含三萜皂甙、有机酸、树脂、糖类、色素、蛋白质、脂肪油等，有解热止渴、利尿、镇咳祛痰等功效，并具抗肿瘤的作用。近年来，随着吊瓜开发和研究的不断深入，吊瓜子也已成为炒货中的佳品，它浓香扑鼻，深受消费者喜爱，市场前景极为广阔。吊瓜通常以种子或扦插繁殖，种子繁殖由于混交严重，种质退化迅速；扦插繁殖时由于病毒病积累，导致大量减产。如何获得优质不带病毒的吊瓜种苗已是吊瓜生产上迫切需要解决的问题。因此，亟需建立一种合适的吊瓜病毒检测方法。
　　目前，植物病毒的检测方法主要有生物学、电镜观察、血清学、ＲＴ－ＰＣＲ和核酸杂交等［１］，但由于生物学检测法周期长，电镜操作需要一定技能，仪器费用高，也不易进行大量样本的集中处理，所以生物学方法和电镜检测在病毒检测中存在很大局限性。血清学方法的应用相对较为广泛［２，３］，但商品化的抗血清价格较高，灵敏度不够高，易出现非特异性反应，检测结果不可靠。而ＲＴ－ＰＣＲ技术具有简便、快速、灵敏度高、特异性强等显著优点，在植物病毒检测中得到了广泛的应用［４－６］。危害葫芦科作物的病毒多达４８种［７］，而且在田间病毒经常还会发生复合感染，目前尚无吊瓜病毒检测相关文献报道，本研究选取了发生普遍、危害严重的ＺＹＭＶ、ＷＭＶ、ＣＭＶ、ＳｑＭＶ、ＰＲＳＶ ５种病毒对采集的田间吊瓜染病样本进行ＲＴ－ＰＣＲ检测，为吊瓜病毒病的防治及抗病育种工作提供了理论依据。
　　１材料和方法
　　１．１材料
　　感染病毒的吊瓜植株来自浙江省长兴县，引种后栽种于杭州师范大学温室。
　　１．２试剂
　　Ｔｒｉｚｏｌ试剂购自Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司；反转录试剂盒购自东洋纺（上海）生物科技有限公司；Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶购自广州东盛生物科技有限公司。
　　１．３总ＲＮＡ的提取
　　取０．２～０．５ ｇ感染病毒的新鲜吊瓜叶片置于处理过的研钵中，加液氮研磨成粉末后迅速转移至１．５ ｍＬ的Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管中，用Ｔｒｉｚｏｌ试剂提取总ＲＮＡ，最后用２０ μＬ ＲＮａｓｅ ｆｒｅｅ Ｈ２Ｏ溶解总ＲＮＡ。
　　１．４引物的设计和合成
　　根据ＧｅｎＢａｎｋ上登录的各病毒序列，用Ｐｒｉｍｅｒ５软件设计各病毒的特异性引物。引物设计完成后，通过ＮＣＢＩ对其特异性进行分析，均具有良好的特异性。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，见表１。
　　１．５ｃＤＮＡ合成和ＰＣＲ扩增
　　用反转录试剂盒合成各病毒ｃＤＮＡ第一链。ＰＣＲ反应在５０ μＬ体系中进行：３６．５ μＬ ｄｄＨ２Ｏ、５．０ μＬ １０×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ、４．０ μＬ 10 μｍｏｌ／Ｌ ｄＮＴＰs、１．０ μＬ 病毒正向引物（１０ μｍｏｌ／Ｌ）、１．０ μＬ病毒反向引物（１０ μｍｏｌ／Ｌ）、２．０ μＬ ｃＤＮＡ模板和０．５ μＬ Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶，ＰＣＲ反应程序：９４ ℃预变性５ ｍｉｎ；９４ ℃变性３０ ｓ、５５ ℃退火３０ ｓ、７２ ℃延伸１ ｍｉｎ，循环３０次；最后７２ ℃延伸１０ ｍｉｎ。ＰＣＲ产物经１．０％琼脂糖凝胶电泳后分析比较。
本文为全文原貌 未安装PDF浏览器用户请先下载安装 原版全文 　　１．６ＰＣＲ产物测序
　　将ＲＴ－ＰＣＲ产物回收纯化后与ｐＭＤ１８－Ｔ Ｖｅｃｔｏｒ连接转化大肠杆菌ＤＨ５α感受态细胞，用氨苄青霉素和β－半乳糖苷酶的底物Ｘ－Ｇａｌ进行蓝白斑筛选。阳性克隆经ＰＣＲ和限制性酶酶切分析进一步筛选后，提取质粒送上海泽衡生物技术有限公司测序，利用ＤＮＡＭＡＮ和ＢＬＡＳＴ对所测序列进行比较分析。
　　２结果与分析
　　２．１染病吊瓜样品与健康吊瓜样品的症状
　　调查发现，浙江长兴吊瓜普遍受病毒侵染，且病毒病后期常导致大量减产，这严重影响了吊瓜产业的发展。染病的吊瓜植株症状主要为花叶、出现小黄斑、叶片黄化，后期黄化坏死（图１－Ａ）；而组培苗也有黄化、出现小黄斑的症状，这说明组培苗还未脱除母株体内的病毒（图１－Ｂ）。未受病毒侵染的健康吊瓜植株叶片深绿，无黄斑、花叶、黄化现象（图１－Ｃ）。
　　２．２５种病毒ＲＴ－ＰＣＲ扩增结果
　　以ＺＹＭＶ、ＷＭＶ、ＣＭＶ、ＳｑＭＶ和ＰＲＳＶ ５种病毒的反转录产物为ＰＣＲ反应的模板，经ＰＣＲ扩增后ＺＹＭＶ、ＷＭＶ、ＣＭＶ、ＳｑＭＶ均未得到相应的条带，仅ＰＲＳＶ得到１条大小５７０ ｂｐ左右的特异性条带（图２），这与按ＰＲＳＶ外壳蛋白基因序列设计的引物目标片段大小相符，说明扩增的条带可能是从ＰＲＳＶ病毒基因组特异扩增得来的，健康阴性对照则无任何扩增条带出现。在１０块不同田地的材料中全部检测到ＰＲＳＶ，检出率达到１００％。
　　
　　２．３ＲＴ－ＰＣＲ检测灵敏度
　　将受病毒侵染的吊瓜叶片总ＲＮＡ按３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６倍梯度稀释为不同浓度后的扩增结果表明，ＲＴ－ＰＣＲ在ＰＲＳＶ病毒ＲＮＡ稀释３５倍时仍能够获得阳性结果（图３），这说明ＲＴ－ＰＣＲ对病毒检测具有较高的灵敏度。
　　
　　２．４ＲＴ－ＰＣＲ对吊瓜不同取样部位的ＰＲＳＶ检测
　　用同一感病植株的茎尖（５ ｍｍ）、幼嫩卷须、横向直径１０ ｍｍ以下的嫩叶、横向直径１０～２０ ｍｍ的嫩叶、嫩茎、老茎、花萼、花瓣、子房、老叶提取ＲＮＡ，分别进行ＲＴ－ＰＣＲ，结果均得到了清晰的扩增条带（图４）。结果表明，病毒ＰＲＳＶ在以上吊瓜组织中均有分布，且不同取样部位的特异扩增条带的强度不同，ＰＲＳＶ在幼嫩卷须、老茎、花萼、花瓣、子房、老叶中扩增较强；在茎尖（５ ｍｍ）、嫩茎处稍弱；在横向直径１０ ｍｍ以下与横向直径１０～２０ ｍｍ的嫩叶处最弱。
　　
　　２．５ＰＣＲ产物序列分析
　　ＰＲＳＶ的ＲＴ－ＰＣＲ扩增产物经纯化后测序。测序结果表明ＰＲＳＶ的扩增产物序列由５７０个核苷酸组成，与设计的ＰＣＲ产物大小相同。序列同源性分析结果表明，所得序列与参考序列的同源率达到９９％，为ＰＲＳＶ基因的部分序列，这进一步证明了ＲＴ－ＰＣＲ检测结果的可靠性。
　　２．６ＲＴ－ＰＣＲ对吊瓜组培苗的检测
　　应用ＲＴ－ＰＣＲ随机抽样检测以茎尖为外植体的吊瓜组培苗４株，结果都检测到未脱除的ＰＲＳＶ（图５）。证明该方法具有较高的准确性，可以用于大量脱毒苗的检测。
　　
　　３结论
　　ＲＴ－ＰＣＲ技术用于植物病毒的检测具有特异性强、灵敏度高、快速简便及所需样品量少等特点，因而对于病毒侵染早期及种子带毒的检测具有重要意义，可以为许多植物病毒的检测所借鉴。
　　本文对来自１０份不同田地的吊瓜染病样本进行了ＲＴ－ＰＣＲ检测，结果从感病组织中全部扩增出与ＰＲＳＶ预期大小一致的目的片段，而健康组织无此扩增产物，说明扩增片段是从ＰＲＳＶ病毒基因组特异扩增得来的，目的片段的序列测定进一步证明了这一点；至于另外４种病毒，ＲＴ－ＰＣＲ均未扩增出任何条带，这说明侵染吊瓜的病毒种类可能为ＰＲＳＶ单一感染。本实验只选取了危害最普遍的５种病毒进行检测，至于有没有这５种病毒以外的其他病毒复合感染，这需要进一步对吊瓜染病症状进行观察研究。
　　为了了解病毒ＰＲＳＶ在宿主体内的分布状况，本实验对吊瓜的不同部位――茎尖（５ ｍｍ）、幼嫩卷须、横向直径１０ ｍｍ以下的嫩叶、横向直径１０～２０ ｍｍ的嫩叶、嫩茎、老茎、花萼、花瓣、子房、老叶的病毒分布进行了检测，这不仅对于寻找合适的外植体部位来对吊瓜进行脱毒处理，进而获得脱毒苗具有重大意义；另外，由于病毒在感病植株体内各组织器官具有不均匀分布特性［８］，这也有效避免了因检测部位差异造成的检测结论偏差。茎尖很少受病毒侵染，所以人们常取茎尖经组培获得脱毒苗。然而在提取ＲＮＡ浓度基本相同的条件下，本实验结果却显示茎尖的病毒表达量高过嫩叶，这可能预示ＰＲＳＶ的表达与植株的代谢强度有关。因为嫩叶代谢强度较茎尖弱，所以其病毒的表达量也相对较低。
　　本实验建立的吊瓜病毒ＲＴ－ＰＣＲ检测方法，在吊瓜栽培生产中，能够快速、准确、简便、经济地检测出幼苗带毒情况，对预防和控制病害在田间的发生、减少经济损失、抗病筛选和病害流行预测具有十分重要的意义。
　　参考文献：
　　［１］ 金羽，文景芝．植物病毒检测方法研究进展［Ｊ］． 黑龙江农业科学，２００５（３）：３７－４０．
　　［２］ 肖火根，范怀忠． 植物组织粗汁液中的番木瓜环斑病毒的ＥＬＩＳＡ检测技术［Ｊ］． 中国病毒学，１９９４，９（３）：２４９－２５５．
　　［３］ 古勤生，ＲＯＧＧＥＲＯ Ｐ，ＬＥＮＺＩ Ｒ，等． 北方地区小西葫芦黄花叶病毒的酶联检测和西瓜品种抗病性鉴定［Ｊ］． 果树学报，２００２， １９（３）：１８４－１８７．
　　［４］ ＪＡＭＥＳ Ｄ． Ｆａｃｔｏｒｓ ａｆｆｅｃｔｉｎｇ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｐｐｌｅ ｓｔｅｍ ｇｒｏｏｖｉｎｇ ｖｉｒｕｓ ｂｙ ＰＣＲ ａｎａｌｙｓｉｓ［Ｊ］． Ａｃｔａ Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒｅ，１９９８，４７２：１１９－１２４．
　　［５］ ＣＡＮＤＲＥＳＳＥ Ｔ，ＬＡＮＮＥＡＵ Ｍ，ＲＥＶＥＲＳ Ｆ，ｅｔ ａｌ． ＰＣＲ－ｂａｓｅｄ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌａｎｔ ｄｉｓｅａｓｅｓ ａｎｄ ｖｉｒｏｉｄｓ［Ｊ］． Ａｃｔａ Ｈｏｔｉｃｕｌｔｕｒｅ，２０００，５３０：６１－６７．
　　［６］ 吴红芝，孔宝华， 郑海如， 等． ＲＴ－ＰＣＲ检测菊花Ｂ病毒的研究［Ｊ］． 西南农业大学学报，２００２，２４（２）：１１５－１１７．
　　［７］ 古勤生，范在丰，李怀方． 葫芦科作物病毒名录［Ｊ］． 中国西瓜甜瓜，２００２（１）：４５－４７．
　　［８］ ＷＨＩＴＥ Ｐ． Ｍｕｌｔｉｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｖｉｒｕｓ ｏｆ ｔｏｙ－ｂａｃｃｏ ａｎｄ ａｕｃｕｂａ ｍｏｓａｉｃ ｏｎ ｇｒｏｗｉｎｇ ｅｘｉｓｉｅｄ ｔｏｍａｔｏ ｒｏｏｔｓ［Ｊ］． Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，１９３４，２４：１００３－１０１１．
本文为全文原貌 未安装PDF浏览器用户请先下载安装 原版全文