葡萄糖脱氢酶法测定血清葡萄糖的方法学评价:葡萄糖脱氢酶

第16卷第4期2006年8月

江苏大学学报(医学版)

JournalofJiangsuUniversity(MedicineEdition)

Vol.16No.4Aug.2006

葡萄糖脱氢酶法测定血清葡萄糖的方法学评价

周丽萍,姜旭淦,徐　军

1

1

2

(江苏大学1.医学技术学院,江苏镇江212001;2.附属人民医院,江苏镇江212002)

[摘　要]　目的:通过方法学试验对葡萄糖脱氢酶法测定血清葡萄糖方法进行评价。方法:用已建立的方法进行重

复性试验、回收试验、干扰试验、线性范围试验,并和HK法进行比较。结果:重复性试验批内CV值为1.33%,批间

CV值为1.42%,总CV值为2.01%;回收试验中回收样品I、Ⅱ、Ⅲ的回收率分别为105%,93.91.4%,平均为

96.6%;干扰试验表明一般浓度的抗凝剂、防腐剂、尿酸、,与HK法比较

其相关性为Y=1.038X-1.172,r=0.994;。结论:[关键词]　方法学评价;[.1]A[文章编号]　1671-7783(2006)04-0301-03

Evaluationofglucosedehydrogenasemethod

fordeterminationofserumglucose

ZHOULi2ping,JIANGXu2gan,XU2jun

1

1

2

(1.SchoolofMedicalTechnology,JiangsuUniversity,ZhenjiangJiangsu,212001;2.theAffiliatedPeople′sHospitalofJiangsuUniversity,ZhenjiangJiangsu,212002,China)

[Abstract]　Objective:Glucosedehydrogenase(GDH)methodfordeterminationofserumglucosewase2valuatedthroughmethodologytest.Methods:Iteration,recovery,interfereandlinelytestweretriedbyanestablishedway,andalsocomparedwithHKmethod.Results:Within2runCV、day2to2dayCVandtotalCVwere1.33%、1.42%and2.01%respectivelybyiteranttest;averagerecoveryratewas96.6%;anticoag2ulant、septic、uricacidandbilirubinunderacertainconcentrationalsodidnotinterferewiththeglucosere2sultinthismethod.ComparedwithHKmethod,thepertinencewasY=1.038X-1.172,r=0.994.Thelinearitystudiesshowedthemethodwaslinearupto20mmol/L.Conclusion:Glucosedehydrogenasemeth2odwasaperfectwayfordeterminationofserumglucose.

[Keywords]　methodevaluation;glucosedehydrogenasemethod;glucose

　　临床生化检验方法的选择和评价,是临床生化

检验质量控制的重要基础工作。目前用于临床血糖

[1]

测定的主要方法是酶法,葡萄糖氧化酶(glucoseoxidase,GOD)法以其经济、实用而作为血糖测定的常规方法,己糖激酶(hexokinase,HK)法以其高准确度和高精密度而作为血糖测定的参考方法。GOD法的测定原理为

β2D2葡萄糖+O2H2O2+42AAP+酚

GOD

其颜色的深浅和葡萄糖含量成正比。

GOD法作为血糖测定的常规方法,第一步反应相当特异,GOD仅作用于β2D葡萄糖,特异性很高,由于过氧化物酶(peroxidase,POD)特异性较差,可作用于血中其他过氧化物,使结果偏高。

HK法的作用原理为:

葡萄糖+ATP

HK

葡萄糖酸+H2O2G262P+ADPG262GA+NADPH

　POD

G262P+NADP

+

G262PDH

NADPH在340nm处光密度与血糖浓度成正比。

[基金项目]镇江市科技计划社会发展资助项目(SH2005028)

[作者简介]周丽萍(1968-),女,江苏宜兴人,硕士,讲师,主要从事生物化学和分子生物学教学与研究。

302　　　　　　　　　　　　江苏大学学报(医学版)　　　　　　　　　　　　　　　　　第16卷

HK特异性低,不仅作用于葡萄糖,也作用于其他单

糖生成相应的62磷酸衍生物,但由于62磷酸葡萄糖

脱氢酶(glucose262phosphatedehydrogenase,G262PDH)的高度特异性,选择性地作用于G262P,结果

司;HK法测血糖试剂盒购自复旦张江科技发展有

限公司;80mmol/L葡萄糖标准液等其他试剂均为国产试剂。1.2　方　法

HK法按《全国临床检验操作规程》操作,

[8]

十分准确,一直作为血糖测定的参考方法。

以上两种测定血糖的方法均需两种酶的参与,自从Merck公司制备了纯度较高的葡萄糖脱氢酶

(glucosedehydrogenase,GDH,EC1.1.1.47),就建立起了具有高度特异的测定葡萄糖的GDH法。

++

GDH能特异的催化β2D葡萄糖和NAD(NADP)生成D2葡萄糖酸内酯和NADH(NADPH)。

+β2D2葡萄糖+NADD2葡)

[2]

报道的方法操作。

1.2.1　重复性试验　按NCCLS评价要求选择含量为6.7mmol/L的标本三份,20次,另,,连续20天,将GDH法按梁志超等

[9]

DH　

NADH(nm处增高的光密度可

2、无溶血、无脂,用GDH法测定求得血糖浓度,2.2mmol/L的血糖浓度备用。

基础样品:血清0.9ml+0.1ml生理盐水回收样品1:血清0.9ml+0.01ml80mmol/L葡萄糖标准液+0.09ml生理盐水

回收样品Ⅱ:血清0.9ml+0.06ml80mmol/L葡萄糖标准液+0.04ml生理盐水

回收样品Ⅲ:血清0.9ml+0.09ml80mmol/L葡萄糖标准液+0.01ml生理盐水

每份样品作双份检测,结果取平均值。1.2.3　干扰试验　采用NCCLS关于干扰试验评价方法,取血糖浓度为6.7mmol/L的血清分成8份,2份分别加入抗凝管与非抗凝管中,其余6管分别加入终浓度为20mg/L,60mg/L和100mg/L的尿酸样品及终浓度为10mg/L,30mg/L和50mg/L的胆红素样品,用GDH法测定血糖浓度。1.2.4　方法比较试验　收集无溶血、无脂浊、无感染病人的血清标本20例,分别用GDH法和HK法做双份测定血清葡萄糖含量,记录并计算两法的测定结果。1.2.5　线性范围试验　80mmol/L葡萄糖标准液用生理盐水分别稀释成浓度为0,2.5,5,10,15,20,30和40mmol/L的葡萄糖应用液,用GDH法测定反应产物光密度。以葡萄糖浓度为横坐标,以其对应的光密度为纵坐标绘制曲线。2　结　果2.1　重复性试验

以对该酶(GDH)活性或其底物(葡萄糖)进行定量分析。用GDH法测定葡萄糖,不仅特异性高,且只需GDH一种酶参与,一步完成,用NAD作为辅酶的酶促效率尽管低于NADP,但NAD远比NADP价格便宜,也不影响其最终结果,因而被人

+

+

+

+

们广泛接受和应用

[3]

。

GDH法目前被大多数人认为可以作为血糖测

定的参考方法,与GOD法和HK法比较,以其更简便、准确、经济而在国外被广泛应用

[4]

,但在我国由

于目前没有自主生产的GDH纯酶制品至今未推广使用。国外研究者主要从牛的心脏以及多种微生物的发酵、分离获得GDH。枯草芽孢杆菌来源的GDH以其产酶量高、纯化方便而被人们广泛地接受和应用。为了获得高产量的GDH,我们通过基因重组技术,从枯草芽孢杆菌成功克隆到GDH基因,转化至大肠杆菌进行表达

[5]

,并对培养条件进行优化,获

[6]

得了较高活力的GDH

,为自主开发GDH提供了

技术储备。我们利用酶促反应动力学原理,按照连续监测法的要求,建立了快速、简便、结果可靠的。本研究采用美国临床

实验室标准委员会(NCCLS)评价方案对葡萄糖脱GDH活性的连续监测法

[7]

氢酶法测定血清葡萄糖进行初步评价以确定其在临床诊断中的地位。1　材料和方法1.1　材　料

血清标本来自江苏大学附属人民医院18～70周岁的门诊及住院病人;葡萄糖脱氢酶(EC1.1.1.47,fromBacillusmegaterium)、NAD购自Sigma公

+

批内CV值为1.33%,批间CV值为1.42%,总

CV值为2.01%。该结果

第4期　　　　　　　　　　　　周丽萍,等.葡萄糖脱氢酶法测定血清葡萄糖的方法学评价303

2.2　回收试验

回收数据见表1。

表1　回收试验的数据处理

样品基础样品回收样品Ⅰ回收样品Ⅱ回收样品Ⅲ平均回收率

测得浓度

1.612.456.108.19

mmol/L

方法测血糖随机误差的大小,在测定过程中尽量排除由于仪器、温度、试剂、标准品缺乏稳定性等因素,保持吸量、计时、混匀等操作的一致性,以排除这些因素带来的随机误差;回收试验用于测定实验方法的比例系统误差,这种误差常随分析物的浓度增加而增加,常因样品中其他物质与分析物竞争分析试剂并与之反应而引起。回收试验是发现分析方法比例系统误差的有效评价方法,通过测定GDH法测血糖的回收率,,;,产生的误差是恒定系统,误差的实际大小随干扰物的浓度而异。常以偏差(Bias)作为统计量,表示系统误差的大小,其值为干扰样品测定值与基础样品测定值之差;方法比较试验是用两种方法同时测定一批标本计算出两种方法间测定结果的差异,以此来估计被评价方法在实际测定病人标本时可能引入的总系统误差的水平,本实验以HK法测血糖的参考方法做对比来评价GDH法测定血糖的总系统误差。在方法比较试验中,相关系数(r)可作为被评价方法可否被接受的一项统计学指标,只有当r≥0.975才能说明两者的相关性良好。

运用以上方法学评价方案评价葡萄糖脱氢酶法测定血糖浓度,结果提示:GDH法可以作为临床血糖测定的方法,结果可靠,抗干扰能力强,完全能满足临床血糖检测的要求。[参考文献]

[1]　林其燧,文庆成.临床化学诊断方法大全[M].北

回收浓度

-0.844.496.58

加入浓度回收率(%)

-0.84.87.2

-10593.591.496.6

如表1所示,计算回收样品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的回收率分别为105%,93.5%和91.4%,平均为96.6%2.3　,100mg/L以下、胆红素浓度在50mg/L以下和加入一般浓度的抗凝剂、防腐剂时,Bias

对1.2.4测定结果分别用SPSS统计软件进行相关性分析,结果显示,其相关性为Y=1.038X-1.172,r=0.994,n=50。说明两法的相关性良好。2.5　线性范围试验结果如图1,由图可知,葡萄糖浓度在20mmol/L以下呈现良好的线性,该浓度覆盖临床上的参考值和常见疾病的医学决定水平

,因此可以满足临床检验的需要。

京:北京大学出版社,1990:178-184.

[2]　BanauchD,BrummerW,EbelingW.Aglucosedehy2

drogenaseforthedeterminationofglucoseconcentrationsinbodyfluids[J].ZKlinChemKlinBiochem,1975,13(3):101-107.

图1　GDH法测定血糖浓度的线性范围试验

[3]　周丽萍,朱晓丽.葡萄糖脱氢酶的研究进展[J].江

3　讨　论

苏大学学报:医学版,2004,14(2):174-176.

[4]　SundaramPV,BlumenbergB,HinschW.Routineglu2

cosedeterminationinserumbyuseofanimmobilizedglucosedehydrogenasenylon2tubereactor[J].chem,1979,25(8):1436-1439.

[5]　周丽萍,赵　燕,王卉放,等.枯草芽孢杆菌葡萄糖脱

Clin

临床生化检验方法的选择和评价,是临床生化

检验质量控制的重要基础工作。当建立一个新的方法,应对它们的技术性能做出评价,以便科学地选择和利用。美国国家临床实验室标准委员会(NC2CLS)制定了一套评价方案,能客观而正确地对方法的技术性能做出评价。重复性试验的结果反应各次测定结果相互接近的程度,用于客观评价GDH测定

氢酶的克隆和表达[J].江苏大学学报:医学版,

2004,14(1):7-10.

(下转第316页)

316　　　　　　　　　　　　江苏大学学报(医学版)　　　　　　　　　　　　　　　　　第16卷

科杂志,2004,25(2):77-80.

[2]　岳林先,邓立强,刘军,等.前列腺外周带血流高阻力

更清晰。

仅根据二维图像有时较难对PC做出诊断,应用彩色多普勒技术更有利于PC的检出。由于前列腺是少血供器官,经腹壁探头由于距离远,彩色血流显示往往不够清晰,经直肠探头由于距离近,探头频率高,CDFI与PDI显示清晰,更易对病变性质做出准确的判断。CDFI和PDI对于PSA异常升高的患者检查前列腺癌具有很大的诊断价值,血流的显示使其敏感性增加了3～4倍。多数前列腺癌起源于外周带,如此区域内病灶或其周围血流信号增加,血流速度加快或阻力增高,癌,可进一步进行穿刺活检。

MRI扫描,学方法,[11]

段。动态对比增强MRI因能快速显示前列腺增强类型及有关肿瘤血管情况而被应用于前列腺癌的诊断,但有时对良性前列腺增生与前列腺癌的鉴别仍有一定困难,而且造影剂费用昂贵,有过敏可能,不适宜作为常规筛查手段用于前列腺癌的诊断。CT平扫对早期前列腺癌的诊断基本无帮助,不能用于诊断A、B期前列腺癌,但可用于前列腺癌的临床分期,动态增强CT可能有一定意义,但也通常不作为诊断前列腺癌首选的检查方法。

综上所述,由于TRUS安全、准确、无痛苦、不需特殊准备、重复性强,较CT、MRI等其他影像学检查更易让病人接受,同时TRUS清晰度高,能清晰显示前列腺内部细小病变,明显优于经腹超声,结合CD2FI与CDE以及DRE与PSA测值可对病变性质做出

[10]

指数对前列腺癌的诊断价值[J].临床超声医学杂志,2004,6(3):133-135.

[3]　刘跃新,焦志友,陈　山,等.腔内超声图像对前列腺

增生诊断标准的初步探讨[J].中国超声医学杂志,

1997,13(8):43-45.

[4]　RoehrbomCG,McConnellJD,LieberM,etal.Serum

prostate2speceficantigenconcentrationisapowerfulpre2dictofacuteurinaryandneedforsurgeryinprhyperplasiaPLESSoup[JU(3):473-480.

[],顾文涛.临床特种检验医学[M].天津:

天津科学技术出版社,2004:97.

[6]　杨全成,李凯,张晓光,等.f/T2PSA比值和PSA密度

对TPSA灰区前列腺癌的诊断意义[J].现代肿瘤医学,2006,14(2):188-190.

[7]　CraigM,GerardJ,AlanW,etal.Contemporaryuseof

complexedPSAandcalculatedpercentfreePSAforearlydetectionofprostatecancer;impactofchangingdiseasedemogaraphics[J].Urology,2001,57:1105-1111.

[8]　刘红君,王佳丽,郭丰富.PSA的临床应用[J].牡丹江

医学院学报,2005,26(5):54-56.

[9]　SpitzJ,EnzmannT,MullerW,etal.Estimationoftoal

PSAwithaSupersensitivePSA2assayduringneo2adju2vant2chemotherapyofprostatecancerbeforeradicalre2sectionofprostate[J].AnticancerResearch,1999,19(4A):2637-2640.

[10]　SauvainJL,PalascakP,BremonJM.PowerDopplerul2

trasonographyandhypoechoicnodulesoftheperipheralprostate:perspectivesandlimitations[J].JRadiol,1997,78(7):1-7.

[11]　蒋学祥,王霄英.国内前列腺癌的MRI和fMRI研究

更准确的判断,为临床治疗提供可靠依据,是目前诊

断前列腺疾病的首选方法。[参考文献]

[1]　孙颖浩.我国前列腺癌的研究现状[J].中华泌尿外

评价[J].中国医学影像技术,2004,20(8):1149.

[收稿日期]　2006-09-19　　[本文编辑]　陈海林

(上接第303页)

[6]　周丽萍,姜旭淦,徐顺高,等.重组葡萄糖脱氢酶基因

[8]　叶应妩,王毓三.全国临床检验操作规程[M].2版.

的表达研究[J].江苏大学学报:医学版,2005,15

(4):291-293.

[7]　姜旭淦,周丽萍,徐顺高,等.葡萄糖脱氢酶连续监测

南京:东南大学出版社,1997:248-250.

[9]　梁志超,刘　敏,王毓三.血清葡萄糖的葡萄糖脱氢

酶测定法[J].临床检验杂志,1996,14(1):20-21.

[收稿日期]　2006-06-15　　[本文编辑]　汪玉芳

法的研究[J].江苏大学学报:医学版,2004,14(6):

536-537.