[乌拉尔甘草愈伤组织石蜡切片与半薄切片的对比] 乌拉尔甘草

　　摘要：以乌拉尔甘草（Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚａ ｕｒａｌｅｎｓｉｓ Ｆｉｃｈ．）不同来源愈伤组织为材料，采用石蜡切片和半薄切片技术，对乌拉尔甘草不同来源愈伤组织细胞进行了观察，结果表明，半薄切片在制作不同来源愈伤组织装片时优于石蜡切片，其清晰度高，分辨率更为精确。石蜡切片中，根源愈伤组织有核细胞较少，而且细胞出现解体现象；半薄切片中观察到了叶源愈伤组织细胞中的着色颗粒、线粒体和圆球体，可为透射电镜制样提供有效的材料。
　　关键词：乌拉尔甘草；愈伤组织；石蜡切片；半薄切片
　　中图分类号：Ｓ５６７．７＋１；Ｑ９４３．１；Ｑ９４－３３６文献标识码：Ａ 文章编号：0439－８114（２０11）12－2487-03
　　
　　Comparison of Paraffin Section and Semi-Thin Section of Glycyrrhiza uralensis Callus
　　
　　ＺＨＡＮＧ Ｘｉｎ１，ＣＡＯ Ｊｕｎ－ｍａｉ１，ＬＩＵ Ｊｉａｎ－ｌｉ１，ＺＨＡＮＧ Ｙａｎ２，ＺＨＥＮＧ Ｓｕ－ｊｉａｏ１
　　（１．Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｎｏｒｔｈ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｆｏｒ Ｎａｔｉｏｎａｌｉｔｉｅｓ， Ｙｉｎｃｈｕａｎ ７５００２１， Ｃｈｉｎａ；
　　２． Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｎｉｎｇｘｉａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｃｉｔｙ， Ｙｉｎｃｈｕａｎ ７５００２１， Ｃｈｉｎａ）
　　
　　Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｃｅｌｌs ｆｒｏｍ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｏｕｒｃｅｓ ｏｆ Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚａ ｕｒａｌｅｎｓｉｓ Ｆｉｃｈ． ｃａｌｌｕｓ ｗere ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｕｓｉｎｇ ｐａｒａｆｆｉｎ ｓｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｅｍｉ－ｔｈｉｎ ｓｅｃｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｔａｋｉｎｇ ｃａｌｌｕｓ ｆｒｏｍ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｏｕｒｃｅｓ ｏｆ Ｇ． ｕｒａｌｅｎｓｉｓ ａｓ ｔｒｉａｌ ｍａｔｅｒｉａｌ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｓｅｍｉ－ｔｈｉｎ ｓｅｃｔｉｏｎ ｗｈｉｃｈ ｈａｄ ｈｉｇｈｅｒ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｌａｒｉｔｙ ｉｎ ｍａｋｉｎｇ ｓｅｃｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｏｕｒｃｅｓ ｏｆ ｃａｌｌｕｓ． Ｉｎ ｐａｒａｆｆｉｎ ｓｅｃｔｉｏｎ， ｃａｌｌｕｓ ｆｒｏｍ Ｇ． ｕｒａｌｅｎｓｉｓ ｒｏｏｔｓ ｈａｄ ｆｅｗ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ｎｕｃｌｅｕｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｃｅｌｌｓ ｐｒｅｓｅｎｔｅｄ ｔｈｅ ｄｉｓｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｐｈｅｎｏｍｅｎｏｎ； Ｃｏｌｏｒｅｄ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ， ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ ａｎｄ ｓｐｈｅｒｏｓｏｍｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｓｅｍｉ－ｔｈｉｎ ｓｅｃｔｉｏｎ ｃｏｕｌｄ be ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｃｌｅａｒｌｙ， ｗｈｉｃｈ ｃｏｕｌｄ ｐｒｏｖｉｄｅ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｍａｔｅｒｉａｌ ｆｏｒ ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ．
　　Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚａ ｕｒａｌｅｎｓｉｓ Ｆｉｃｈ．； ｃａｌｌｕｓ； ｐａｒａｆｆｉｎ ｓｅｃｔｉｏｎ； ｓｅｍｉ－ｔｈｉｎ ｓｅｃｔｉｏｎ
　　
　　石蜡切片是组织学、发育生物学研究的主要试验方法，其优点是适合多数植物做组织切片观察，因而有关研究石蜡切片的报道文献较多［１－６］。半薄切片也是一种常用的制片技术，半薄切片制备中的一些关键技术如切片、捞片、脱脂、染色等环节直接影响半薄切片的质量；半薄切片在制作不同植物愈伤组织装片时优于石蜡切片，能较好地保存组织细胞的结构，其清晰度高，分辨率更为精确，但较石蜡切片成本高；而用于乌拉尔甘草（Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚａ ｕｒａｌｅｎｓｉｓ Ｆｉｃｈ．）愈伤组织细胞结构观察的石蜡切片与半薄切片比较分析研究尚未见报道，为此开展了这方面的研究，现将结果报告如下。
　　１材料与方法
　　１．１材料
　　用乌拉尔甘草的根、芽、叶诱导的愈伤组织由北方民族大学细胞生物学实验室提供。染料有番红、固绿、甲苯胺蓝，试剂有冰醋酸、甲醛、二甲苯、石醋、３％戊二醛、０．１ ｍｍｏｌ／Ｌ磷酸缓冲液（pH值6.8）、１％锇酸、梯度酒精（３０％、５０％、７０％、８０％、９０％、１００％）、环氧丙烷、环氧树脂、十二烷基琥珀酸酐、邻苯－二甲酸二丁酯、２，４，６－三甲氨基苯酚等，均为分析纯。仪器主要是Ｏｌｙｍｐｕｓ生物显微镜、实验型冰箱、温箱、包埋板、切片机等。
　　１．２方法
　　１．２．１石蜡切片制作取乌拉尔甘草不同来源的愈伤组织，进行常规石蜡切片制作［７］，用番红和固绿进行双重染色。
　　１．２．２半薄切片制作①取材及固定。沿着乌拉尔甘草不同来源愈伤组织的生长方向，将其切成 ０．５～１．０ ｍｍ３大小的小块；把切割下来的材料浸入３％戊二醛中，并将其置于４ ℃的冰箱中固定５ ｈ（前固定）；将材料从固定液中取出，用０．１ ｍｍｏｌ／Ｌ磷酸缓冲液（ｐＨ值６．８）洗涤３～４次，每次３０ ｍｉｎ，可不断地摇动容器，使缓冲液迅速进入组织取代残存的戊二醛溶液；将洗涤的材料放入１％锇酸中，于４ ℃冰箱中放置１６ ｈ（后固定）；将后固定的材料取出，用０．１ ｍｍｏｌ／Ｌ磷酸缓冲液洗涤３次，每次３０ ｍｉｎ，洗去细胞中残存的锇酸。②脱水及渗透。采用酒精，按３０％、５０％、７０％、８０％、９０％、１００％（２次）进行梯度处理，每级梯度处理１０ ｍｉｎ，但１００％酒精处理１５ ｍｉｎ。环氧丙烷渗透（２次）１５ ｍｉｎ；用一份不完全包埋液加一份环氧丙烷溶液渗透１ ｈ；用两份不完全包埋液加一份环氧丙烷溶液渗透１ ｈ；然后在完全包埋液中过夜，包埋液配方为环氧树脂４．５０ ｇ、十二烷基琥珀酸酐４．５０ ｇ、邻苯－二甲酸二丁酯０．１５ ｇ、２，４，６－三甲氨基苯酚０．０７５ ｍＬ。③包埋。完全包埋液浸泡材料于３５ ℃温箱６ ｈ，转移至包埋板，４２ ℃温箱过夜。④切片、展片及粘片。先将愈伤组织小块切成正方体或长方体，展片时，在清洁的载玻片上加一滴去离子水，再将切下的组织块放在水滴的表面，然后展片（包埋剂不必除去，它本身与玻璃还有一定的粘着力，也可不使用粘着剂进行粘片）；待切片平展后，用纱布或吸水纸吸取多余的水分，在平台上使水分完全蒸发即可。⑤染色。将甲苯胺蓝染液滴在载玻片的材料上１～２ ｍｉｎ，去离子水清洗，并在室温下干燥［８］。
　　１．２．３观察拍照挑取制作效果好的装片，在Ｏｌｙｍｐｕｓ显微镜下，利用Ｍｏｔｉｃ Ｉｍａｇｅ ３．２软件进行拍照。
　　２结果与分析
　　２．１不同来源愈伤组织石蜡切片的观察
　　对乌拉尔甘草不同来源的愈伤组织石蜡切片的观察结果见图１，由图１可见，番红将细胞核染成玫红色；固绿将细胞质、细胞壁染为绿色。由此可清晰地看出根源愈伤组织细胞排列疏松，细胞质着色浅，有核细胞少，且细胞出现解体现象；叶源愈伤组织细胞排列较紧密，细胞质着色浅，有核细胞多；芽源愈伤组织细胞排列紧密，细胞质着色浓，有核细胞多且密集。这说明不同来源愈伤组织的细胞存在组织结构上的差异，特别是根源愈伤组织的无核细胞多，导致分生能力低，为再分化的实现加大了技术难度。
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　　对乌拉尔甘草不同来源的愈伤组织半薄切片的观察结果见图２，由图２可见，根源愈伤组织细胞质着色程度不同，液泡未着色，呈白色，且可以看到细胞质内有较多着色颗粒具有细胞核，细胞液泡化程度低，说明细胞分裂不旺盛，但细胞内贮藏的物质较多；叶源愈伤组织细胞质部分被着色，液泡化程度较高，还可以看到着色的线粒体和圆球体，说明细胞分裂较旺盛；芽源愈伤组织大部分细胞未着色，液泡多，液泡化程度高，且可以看到较多的着色颗粒，说明细胞分裂旺盛。将这个观察结果与石蜡切片观察结果进行比较，可以清楚地看到，通过半薄切片技术可以更加全面地反映出乌拉尔甘草不同来源愈伤组织细胞的分裂状况。
　　３讨论
　　石蜡切片在制片过程中要经过酒精、二甲苯等有机溶剂的处理，组织内活性物质如蛋白质会产生变性或酶失活，还有某些内含物易于消失，常使组织变小，甚至使组织扭曲变形，细胞所含物质缩小而折光性增强，影响观察结果的客观性。半薄切片图像的清晰度、分辨率远优于石蜡切片，视野也大于石蜡切片，有利于获得高质量的光镜图像，但成本高于石蜡切片。此外，还可为透射电镜制样提供有效的材料。
　　番红－固绿对染法是植物切片中最常见的二重染色方法，番红是碱性染料，能使细胞核及木质化的细胞壁着色；固绿是酸性染料，能使细胞质着色。在图１中可见，乌拉尔甘草根源愈伤组织有核细胞较少，而且细胞出现解体现象，这说明乌拉尔甘草根源愈伤组织细胞不再具有分生能力，而转化为储藏细胞或通气组织，此观点与孔妤等［9］的研究结果相一致。甲苯胺蓝是碱性染料，着色物质是蛋白质颗粒或含有蛋白质的物质，对液泡不着色。从图２中可明显地看出，乌拉尔甘草芽源愈伤组织液泡化程度最高，其次为叶源愈伤组织，根源愈伤组织液泡化程度最低，从这点也证明了不同来源愈伤组织分生能力的强弱。
　　试验在半薄切片中，观察到了细胞中的着色颗粒、线粒体和圆球体；而在石蜡切片中仅观察到了着色的细胞核，其他结构不能观察到。分析原因，可能是由于乌拉尔甘草愈伤组织为幼嫩材料，在各级脱水时间、酒精梯度处置及透明时间、浸蜡温度等环节里，都出现了影响制片质量的问题，由此说明这些显微结构的不同，可能与不同来源愈伤组织分生能力不同有关联。
　　参考文献：
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　　［４］ 杨群，胥维勇． 影响组织切片制作质量几个因素的分析及改进方法［Ｊ］． 中国组织化学与细胞化学杂志，２００５，１４（１）：１１９－１２０．
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　　［８］ 刘冬娟，祝素文，李艳杰． 硼砂甲苯胺蓝染液在半薄切片染色上的应用［Ｊ］． 中国医科大学学报，２００４，３３（１）：３３．
　　［9］ 孔妤，王忠，顾蕴洁，等． 植物根内通气组织形成机理的研究进展［Ｊ］． 植物学报，２００8，25（2）：248-253．
　　注：本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文
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