银耳芽孢内源gpd启动子的克隆与功能鉴定_gpd

　　利用反向长距离PCR技术从银耳(Tremella fuciformis)芽孢gpd基因出发克隆上游gpd启动子序列，将预测的gpd启动子片段与多功能纤维素基因（mfc）连接构建表达载体，与潮霉素抗性质粒pBgGl-hph共转化银耳芽孢，对拟共转化子进行酶活发酵试验。结果表明：4轮反向长距离PCR克隆得到了1761 bp的上游序列，经预测启动子落在上游1000 bp左右区域内，包含两个高分值的起始转录位点，将gpd启动子分成gpdTre1（885 bp）、gpdTre2（708 bp）、gpdTre3（466 bp）3段区域，分别与多功能纤维素基因（mfc）构建表达载体pgTre1-mfc、pgTre2-mfc和pgTre3-mfc。拟共转化子酶活发酵试验结果发现3个表达载体的转化子均能检测到多功能纤维素酶活，转化子T1-2包含gpdTre1启动子大片段，整体酶活最高，CMC酶活为 14.12 U/mL，比出发菌株Tr01提高34.3%，比工程菌株yLes3提高25.7%，木聚糖酶活为34.8 U/mL，比Tr01酶活提高26.3%，略低于yLes3。3个启动子片段均具有表达活性，相比之下 885 bp的大片段gpd启动子表达活性更高。
　　银耳； 芽孢； gpd启动子； 反向长距离PCR； 多功能纤维素酶
　　银耳(Tremella fuciformis)俗称白木耳，是著名的食药用真菌，隶属于真菌门（Eumycota）、异隔担子菌亚纲（Heterobasidiomycetes）、银耳目（Tremellales）、银耳科（Tremellaceae）、银耳属（Tremella）。近年来，关于银耳栽培技术、加工及药用价值的研究取得了快速发展，然而，与其它真核生物相比，银耳表达系统的研究基础还相当薄弱，特别是关于启动子方面的研究。
　　银耳担孢子芽殖产生酵母状分生孢子称为银耳芽孢。银耳芽孢单核，后代遗传稳定，能像酵母那样快速生长且容易培养，已有较完善的液体深层发酵培养技术［1］，具有完整的蛋白表达修饰系统，是一种优良的外源基因表达宿主。启动子是外源基因表达系统表达调控的重要顺式元件，是影响转录起始效率的重要因素，很大程度上决定基因的转录速率及基因表达效果。
　　在异源表达中，使用同源或近源的启动子有利于受体细胞调控因子的识别，减少甲基化，促进外源基因整合到染色体上，提高转化及表达效率［2-4］。目前在银耳基因工程中广泛应用的启动子均为异源启动子，如CaMV35S启动子，构巢曲霉（Aspergillus nidulans）gpdAn 启动子、香菇（Lentinus edodes）gpdLe启动子、灵芝（Ganoderma lucidum）gpdGl启动子 ［5-8］等，经常会出现无法启始转录或启始转录活性很低等现象，从而导致银耳转化效率低，外源基因表达水平低等难题。gpd (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) 基因是糖酵解途径的关键酶基因，其启动子具有很强的调控异源基因表达的活性，最早从酿酒酵母中分离并被证实［9］。目前食用菌遗传转化的最常用的启动子为ras启动子和gpd启动子，1999年，HIRANO 等［10］首次从香菇中分离得到gpd启动子，并证实了gpd启动子能有效地调控外源基因在香菇中的表达，且后代遗传稳定，比ras启动子具有更高的启动子功能活性。目前，已相继从裂褶菌（Schizophyllum commune)、双孢蘑菇（Agaricus bisporus）、金针菇（Flammulina velutipes）、云芝（Polystictus versicolor）、草菇 （Volvariella volvacea）、灰树花 （Griflola frondosa）等［11-15］食用菌中分离得到gpd启动子，且在各自的同源转化中表现出很强的功能活性。但是目前还没有从银耳芽孢中克隆分离得到完整的gpd启动子的报道。
　　本研究采用反向长距离PCR（LD-IPCR）克隆银耳芽孢内源gpd启动子，该技术克服了传统IPCR中扩增片段小、假阳性多的不足［16］，与巢式PCR技术结合，具有良好的特异性及灵敏度［17］，是克隆启动子序列快速、简便、经济的方法。银耳芽孢内源gpd启动子的克隆不仅可以解决银耳外源表达的问题，还可为食用菌表达系统提供更多可选的有效强启动子。
　　1 材料与方法
　　1.1菌株
　　银耳(T. fuciformis)菌株Tr01购自福建古田食用菌研究所；yLes3为香菇(L. edodes) gpdLes启动子驱动表达多功能纤维素酶的银耳芽孢工程菌株，由华南农业大学食品学院生物炼制实验室构建。
　　1.2质粒
　　质粒pgLes-mfc 含多功能纤维素酶mfc基因［18］及香菇gpdLes启动子，质粒pBgGl-hph含潮霉素抗性hph基因及灵芝gpdGl启动子，均由华南农业大学食品学院生物炼制实验室构建。
　　1.3培养基
　　PDSB培养基（1 L）：200 g去皮马铃薯，20 g葡萄糖，3 g KH 2PO 4，3 g MgSO 4?7H 2O， pH自然；PDSA培养基（1 L）：PDSB培养基另加入 20 g琼脂；CMC刚果红固体培养基（1 L）：10 g羧甲基纤维素钠，4 g (NH 4) 2SO 4，2 g刚果红，1 g KH 2PO 4，1 g NaCl，0.5 g MgSO 4?7H 2O，琼脂粉20 g；纤维素酶发酵培养基（1 L）：20 g甘蔗渣粉末，4 g酵母浸膏，1 g K 2HPO 4， 1 g MgSO 4?7H 2O，0.46 g KH 2PO 4。
　　1.4银耳芽孢总DNA的提取
　　采用PDSA平板于28 ℃活化培养银耳芽孢4 d，从中挑取单菌落接种到装有100 mL PDSB培养基的250 mL摇瓶28 ℃培养3 d，4629 g离心培养液收集银耳芽孢，采用FDEB法提取芽孢的总DNA［14］。