紫芝超临界萃取物中3种三萜醇的分离与鉴定 三萜醇

　　经超微粉碎获得人工栽培紫芝（Ganoderma sinense）子实体超细粉，以乙醇为改性剂，应用超临界CO 2流体萃取技术获得紫芝萃取物（醇溶性部位）；从萃取物的石油醚-乙酸乙酯洗脱物中分离得到3个化合物，采用显微熔点测定仪、红外分光光度计和超导核磁共振仪分别鉴定为灵芝醇A（ganoderiol A）、ganodermadiol和灵芝酮三醇（ganodermanontrio1）。
　　紫芝； 超临界流体萃取； 三萜醇
　　近年来，国内外有关紫芝化学成分的报道，均是以野生紫芝（Ganoderma sinense）作为研究材料，通过系统有机溶剂萃取与分离得到［1-8］。实际上，野生紫芝资源的开发利用已获得了成功，可以采用阔叶树枝桠材为栽培材料，进行商品化栽培子实体并用于产后加工（超微粉碎） ［9,10］。目前，已有超临界流体萃取技术在灵芝（G. lucidum）子实体化学成分的快速分离与检测上应用的报道［11,12］。笔者曾采用超临界流体萃取技术与高效液相色谱-质谱离线联用模式提取分离、检测了紫芝的化学成分［13］。本文进一步报道有关紫芝超临界流体萃取物化学成分的分离与鉴定。
　　1 材料与方法
　　1.1紫芝来源
　　人工栽培的“闽紫96”干燥子实体由中国科学院微生物研究所张小青研究员鉴定为紫芝（G. sinense），并保藏于该所菌物标本馆（标本号为HMAS 77207M）。
　　1.2主要试剂和仪器
　　食品级液态CO 2为福州金元工业气体有限公司产品，200～300目硅胶为青岛海洋化工厂产品；RT-04小型高速粉碎机为北京燕山正德机械设备有限公司产品，HA131-50-01超临界萃取装置为南通市华安超临界萃取有限公司产品，XT-5B显微熔点测定仪为北京市科仪电光仪器厂产品，PE-983G 红外分光光度计为美国PE公司产品，Agilent 1100 LC /MSD Trap离子阱液质联用仪为美国安捷伦科技公司产品，AM-400、DRX-500超导核磁共振仪为德国Bruker公司产品。
　　1.3紫芝超细粉制备
　　取6～8 kg干燥子实体，经切片、小型高速粉碎机粗粉碎，按照参考文献［9］的操作方法得300目紫芝超细粉，每份200 g真空包装，4 ℃冷藏备用。
　　1.4超临界改性CO 2流体萃取
　　采用超临界萃取装置，物料为300目紫芝超细粉，萃取釜装料量为200 g/L（m/v）；液态CO 2（纯度≥99.5%），夹带剂为乙醇（分析纯），作为改性剂；萃取条件：压力30 MPa，温度40 ℃，CO 2流量为30 L/h，夹带剂用量为CO 2流量的10%（于第2分离釜回收利用），萃取时间1.5 h；分离条件：压力8 MPa，温度50 ℃（第3分离釜设为系统保护）。合并25～30份萃取物（油状液体），室温沉析备用。
　　1.5三萜醇的分离与鉴定
　　取备用萃取物（醇溶性部位）约100 g，离心(5000 g，15 min)收集上清液底部的少量沉析物［13］，将沉析物溶于适量石油醚（6～8 mL）再与上清液合并，再用200～300目硅胶搅拌均匀，并挥去石油醚得含萃取物硅胶，湿法装柱，干法上样，装入ZCX-Ⅲ型硅胶（粒度为54～74 μm，比表面为200～300 m2/g）柱层析，依次用不同体积分数（9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5、4∶6、3∶7、2∶8、1∶9）的石油醚-乙酸乙脂溶液梯度洗脱，分部收集，紫外检测（λ=280 nm）合并馏分，浓缩得1个组分，取14.5 g该组分再次层析、梯度洗脱(同上)，分部收集，经薄层色谱扫描检测(λ=243 nm，展开剂为1%乙酸∶水-乙腈=45∶55）［14］定性获得其中具三萜醇紫外吸收特性的组分，重结晶（丙酮∶氯仿=9∶1，v/v）用于结构鉴定。
　　熔点测定采用显微熔点测定仪，观察样品的熔化过程，记录初熔和终熔数值。红外光谱鉴定采用红外分光光度计，用KBr压片制样，参照红外光谱分析方法通则GB/T 6040-2002［15］进行。质谱分析采用离子阱液质联用仪。电喷雾离子化源（ESI），极性检出模式为正模式(MS+)；毛细管电压4000 V，雾化气压力20 psi；干燥气（N 2）流速6 L/min，温度300 ℃；检测方式为一、二级全扫描；最大积聚时间300 ms，全程扫描时间 1 min，具体操作方法按照参考文献［13］进行。氢谱、碳谱分析采用超导核磁共振仪，氘代试剂为CDCl 3，分别在观察频率400 MHz和 100 MHz下进行1H-NMR和13C-NMR测定，以TMS (四甲基硅烷)为内标计算化学位移(δH和δC，ppm)，具体操作方法参照文献［2］、［5］进行。
　　2 结果与分析
　　经过重结晶，化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ分别得到45、10和22 mg。
　　2.1化合物Ⅰ——灵芝醇A
　　白色晶体，mp 230～232 ℃。IR［KBr］cm-1：3384, 2980, 2920,2880,1640,1622, 1036。ESI-MS m/z：474［M］+, 456［M-H 2O］ +, 441［456-CH3］ +。1H-NMR［CDCl 3,400 MHz］ δ：5.48(1H,m, H-7), 5.32(1H,d, J=6.2 Hz, H-11),3.83(1H, d,J =11.1 Hz, H-26), 3.48(1H, d,J= 11.1 Hz,H-26 ), 3.45(1H,dd, J= 10.5, 1.0 Hz, H-24), 3.25(1H,dd, J=11.4, 4.4 Hz, H-3), 1.11(3H,s, CH 3-27), 1.01(3H,s, CH 3-19), 0.98(3H,s, CH 3-28), 0.92(3H,d,J= 6.2 Hz, CH 3-21), 0.88(6H,s, CH 3-29), 0.88(6H,s, CH 3-30), 0.57(3H,s, CH 3-18)。 13C-NMR ［CDCl 3,100 MHz］ δ：35.8(C-1), 27.9(C-2), 79.3(C-3),38.7(C-4), 49.2(C-5), 23.0(C-6),120.3 (C-7),142.7(C-8), 146.0(C-9), 37.4(C-10),116.2(C-11),37.9 (C-12), 43.8(C-13),50.4(C-14),27.7(C-15), 31.5 (C-16), 51.1(C-17), 15.8(C-18), 22.7(C-19),36.6(C-20), 18.7 (C-21), 33.6(C-22), 28.9(C-23),79.0 (C-24), 73.9(C-25), 67.7(C-26), 21.0(C-27), 25.6(C-28), 28.2(C-29), 15.73 (C-30)。