[茶叶发酵过程中多酚变化规律及抗氧化性研究]从茶叶中提取的多酚类抗氧化物是

　　摘要：通过对茶叶进行单一菌种和混合菌种的人工接种发酵，采用微波辅助浸提茶多酚，来研究茶叶发酵过程中多酚的变化规律及不同菌株发酵产物的抗氧化活性。结果表明，茶叶在发酵过程中多酚的含量随发酵时间的延长而降低，其中接种黑曲霉、酵母菌及接种黑曲霉、酵母菌、根曲霉、青霉的茶叶中多酚含量变化趋势明显，分别从３１．１６％降到５．３２％，３１．１６％降到７．３５％；不同菌种发酵产物的抗氧化能力存在差别，提取物的抗氧化能力随时间延长呈现先增后减的变化趋势。
　　关键词：茶叶发酵；菌种；多酚；抗氧化
　　中图分类号：Ｓ５７１．１文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０11）15－3144-04
　　
　　Ｓｔｕｄy ｏｎ Ｖａｒｉａｔｉｏｎ Ｆｅａｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌ ｉｎ Ｔｅａ Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｐｒｏｃｅｓｓ
　　
　　ＺＨＡＮＧ Ｔｉａｎ－ｙｉｎｇ１，２，ＺＨＩ Ｃｈｕｎ－ｘｉａｎｇ２，ＺＨＡＮＧ Ｈａｏ１，ＣＨＥＮ Ｈｕｉ－ｊｕａｎ１，ＳＨＡＮ Ｓｈｕ－ｌｉｎ１，ＭＯ Ｈａｉ－ｚｈｅｎ１
　　（１． Ｈｅｎａｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｘｉｎｘｉａｎｇ ４５３０００， Ｈｅｎａｎ，Ｃｈｉｎａ；
　　２． Ｈｅｎａｎ Ｓｈａｎｇｓｈｕｉ Ａｎｉｍａｌ Ｈｕｓｂａｎｄｒｙ Ｂｕｒｅａｕ，Shangshui ４６６１００， Ｈｅｎａｎ，Ｃｈｉｎａ）
　　
　　Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｅａ ｗａｓ ｉｎｏｃｕｌａｔｅｄ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｅｄ ｗｉｔｈ ａ ｓｉｎｇｌｅ ｓｔｒａｉｎ ａｎｄ ｍｉｘｅｄ ｓｔrａｉｎｓ． Ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ｍｉｃｒｏｗａｖｅ ａｓｓｉｓｔｅｄ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｅａ ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌｓ， ｔｈｅ ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌ ａｎｄ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｅｘｔｒａｃｔｓ were ｓｔｕｄｉｅｄ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓ ｏｆ ｔｅａ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ： ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｔｅａ ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌｓ ｉｎ ｔｈｅ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ prolonging ｏｆ ｔｈｅ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ，ｅｓｐｅｃｉａｌｌｙ ｔｈｅ ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌ ｏｆ ｔｈｅ ｔｅａ ｉｎｏｃｕｌａｔｅｄ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ ａｎｄ ｙｅａｓｔ ａｎｄ ｉｎｏｃｕｌａｔｅｄ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ， ｙｅａｓｔ， ｒｏｏｔ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｎｄ Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｖａｒｉｅｄ ｏｂｖｉｏｕｓｌｙ． Ｔｈｅｙ ｒｅｄｕｃｅｄ ｆｒｏｍ ３１．１６％ ｔｏ ５．３２％， ｆｒｏｍ ３１．１６％ ｔｏ ７．３５％； ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔ ｏｆ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｔｒａｉｎｓ ｄｉｆｆｅｒｅｄ ｉｎ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ｃａｐａｃｉｔｙ ｉｎ ｔｈｅ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓ， ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｔｅａ ｅｘｔｒａｃｔｓ ｉｎｃｒｅａｓｅd ａｎｄ ｔｈｅｎ ｄｅｃｒｅａｓｅd ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｔｉｍｅ prolonged．
　　Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： tea ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ； ｓｔｒａｉｎｓ； ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌ； ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ａｃｔｉｖｉｔｙ
　　普洱茶具有一定的保健作用，其抗氧化作用被认为是其保健功能最重要的机理。目前国内外有关绿茶和红茶的抗氧化作用及机理研究报道很多，而关于普洱茶的报道还非常有限，对普洱茶发酵过程中抗氧化活性的报道更少［１－３］。茶多酚又称茶鞣或茶单宁，是茶叶中的一种主要活性成分，有着独特的抗氧化效果［４］。茶叶中多酚类很多，包括黄烷醇类、花色苷类、黄酮类、黄酮醇类和酚酸类等，这些物质统称为茶多酚，是形成茶叶色香味的主要成分之一，是影响茶叶品质好坏的重要标志［５］，也是茶叶中有保健功能的主要成分之一。在茶叶发酵过程中，微生物直接影响普洱茶风味的形成，有关研究报道显示，天然发酵的普洱茶中的菌种有黑曲霉、根曲霉、青霉和酵母菌［６－９］。其中，黑曲霉数量处于优势地位，其次是酵母菌。不同的菌种产生不同的产物，从而对茶叶的品质产生不同的影响［１０］。
　　通过人工接种发酵，不同的微生物在发酵过程中也会造成多酚类结构、含量和功能性质的变化［１１－１２］。在不同微生物的作用下，通过对茶多酚的变化规律以及提取物抗氧化活性的研究，对进一步开展发酵茶功能性成分的研究和发酵菌种的选择具有一定的指导意义。
　　１材料与方法
　　１．１材料
　　１．１．１原料普洱茶由杭州中国农业科学院茶叶研究所提供。
　　１．１．２试剂无水乙醇、硫酸亚铁、酒石酸钾钠、十二水磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、铁氰化钾、三氯乙酸、硫氰酸铵、二苯代苦味酰基自由基（ＤＰＰＨ）等均为分析纯；磷酸缓冲液（ｐＨ ６．６，０．２ ｍｏｌ／Ｌ）。
　　１．１．３仪器ＳＨＰ型生化培养箱，北京中兴伟业仪器有限公司；电冰箱，中国新飞集团；无菌操作台，上海新艺仪器厂；ＸＯＧＯＺ型高压灭菌锅，山东新华医疗器械厂；１０１型电热鼓风干燥箱，北京市永光明医疗仪器厂；ＭＤ１００－２型分析天平，上海天平仪器厂；ＴＤＬ５０Ｂ台式离心机，上海安亭科学仪器厂；Ｇ８０Ｆ２０Ｎ２Ｌ－ＤＧ（Ｓ０）格兰仕微波炉，格兰仕（中山）电器有限公司；ＷＦＪ７２００型可见分光光度计，尤尼柯（上海）仪器有限公司。
　　１．２方法
　　１．２．１普洱茶优势菌的分离与纯化称取１ ｇ普洱熟茶样品，置于培养皿中，用无菌去离子水冲洗１次，将样品转移至无菌研钵中研碎。将处理好的样品在无菌操作室里涂布，将涂布过的平板培养基倒置于２８ ℃条件下暗培养３６ ｈ。用接种环在各菌落上挑取少量在平板培养基表面“Ｚ”形接种。将接种过的平板培养基倒置于２８ ℃条件下暗培养。根据初分菌落的形态特征，用接种针挑取各菌落的少量菌丝体，接种在事先准备好的ＰＤＡ琼脂培养基上（每个平板内接种３个菌落）。通过继代反复培养，得到纯化的黑曲霉、酵母菌、根曲霉、青霉。
　　１．２．２发酵试验在分离出的纯化菌种中，选取菌种制备菌种液，每个处理用茶叶１００ ｇ，加水量为茶叶质量的３０％，分别用不同的菌种液进行接种，菌种液分别为黑曲霉，（黑曲霉、酵母菌），（黑曲霉、酵母菌、根曲霉、青霉），自然发酵４种，分别命名为处理１、处理２、处理３和处理４，在温度５０℃、湿度为７０％～９０％的条件下培养，每３ ｄ测１次茶多酚含量［１３，１４］。
　　制备菌种液时，总的菌种量是一定的，按一定比例接种菌种，挑选长势均匀的培养基，以１ ｃｍ２为单位的菌种量来制备菌种液。本试验采用接种总量为１ ｃｍ２的菌种量来接种。
　　１．２．３微波法辅助提取茶多酚称取２ ｇ茶叶，用４０％乙醇浸提，在料液比为１∶９ （Ｗ／Ｖ，ｇ∶ｍＬ，下同），微波功率为２８０ Ｗ（中低火档）的条件下，在微波炉中加热３０ ｓ，静置冷却接近室温，再加热３０ ｓ，静置冷却至室温，离心分离得上清液，定容至２５ ｍＬ，备用［１５－１７］。
　　发酵过程中，由于茶叶含水量较高，不易研磨，微波浸提前先把茶叶烘干（５０ ℃），易于研磨，然后再１０３ ℃烘干直至恒重，测茶叶的干物质含量。
　　１．２．４分光光度法测茶多酚含量测定方法参照ＧＢ／Ｔ８３１３－２００２茶多酚测定。具体方法如下：准确吸取样液０．０８０ ｍＬ，注入２５ ｍＬ的容量瓶中，加水４ ｍＬ和酒石酸亚铁溶液５ ｍＬ，充分混合，再加ｐＨ ７．５的磷酸盐缓冲液至刻度，用１０ ｍｍ比色杯，在波长５４０ ｎｍ处，以试剂空白溶液作参比，测定吸光度（Ａ）。茶多酚含量（以干态质量分数表示，％）计算公式如下。
　　茶多酚含量＝Ａ×１．９７５×２×Ｌ１×１００／１ ０００×Ｌ２×Ｍ０×ｍ
　　式中，Ｌ１为试液的总量，ｍＬ；Ｌ２为测定时的用液量，ｍＬ；Ｍ０为试样的质量，ｇ；ｍ为试样干物质含量，％；Ａ为试样的吸光度；１．９７５为用１０ ｍｍ比色杯，当吸光度等于０．５０时，每毫升茶汤中含茶多酚相当于１．９７５ ｍｇ。
　　１．２．５抗氧化能力的测定
　　１）ＤＰＰＨ自由基清除力测定。参照文献［１８，１９］ＤＰＰＨ自由基清除力的测定方法，准确称量０．０３９ ４ ｇ ＤＰＰＨ，无水乙醇定容至５００ ｍＬ容量瓶中，得到浓度为０．２ ｍｍｏｌ／Ｌ的ＤＰＰＨ无水乙醇溶液，４ ℃下避光保存备用。
　　分别吸取不同浓度的样品和无水乙醇溶液２．０ ｍＬ，加入０．２ ｍｍｏｌ／Ｌ的ＤＰＰＨ无水乙醇溶液２．０ ｍＬ，摇匀后，于室温黑暗处放置３０ ｍｉｎ。以无水乙醇调零，测定５１７ ｎｍ处的吸光值Ａ样品； 同时，测定样品溶液２．０ ｍＬ与无水乙醇２．０ ｍＬ混合液在５１７ ｎｍ处的吸光值Ａ空白，再测定ＤＰＰＨ无水乙醇溶液２．０
　　ｍＬ与无水乙醇２．０ ｍＬ在５１７ ｎｍ处的吸光值Ａ对照， 同一测定均重复３次。ＤＰＰＨ自由基清除率的计算公式如下。
　　２）还原力测定。参照豆海港等［２０］的方法，取０．５ ｍＬ不同的样品液和４０％乙醇水溶液，分别加入２．５ ｍＬ磷酸缓冲液（ｐＨ６．６，０．２ ｍｏｌ／Ｌ）及２．５ ｍＬ １％ Ｋ３Ｆｅ（ＣＮ）６，于５０ ℃水浴中反应２０ ｍｉｎ后迅速冷却，并加入２．５ ｍＬ １０％的三氯乙酸溶液，以３ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心１０ ｍｉｎ后取上清液２．５ ｍＬ，并加入２．５ ｍＬ去离子水及０．５ ｍＬ ０．１％ ＦｅＣｌ３溶液，混合均匀，于１０ ｍｉｎ后以空白样品调零，测定各样品７００ ｎｍ的吸光度。
　　２结果与分析
　　２．１ 普洱茶优势菌种分离鉴定结果
　　通过对普洱茶中的微生物进行培养分离与纯化，经显微镜镜检和真菌鉴定手册标准图谱对照，初步鉴定得到的菌种有黑曲霉、根曲霉、青霉和酵母菌。
　　２．２ 发酵过程中茶多酚变化规律
　　在整个茶叶发酵过程中多酚的含量都呈下降的趋势，不同的菌种，多酚下降的趋势不同。自然发酵相对于人工接种发酵的茶叶中多酚下降速度缓慢。由图１可知，在茶叶发酵过程中接种黑曲霉，多酚含量呈下降趋势，在前６ ｄ变化趋势较明显；在黑曲霉、酵母菌的作用下，茶叶发酵过程中多酚含量呈明显的下降趋势。在黑曲霉、酵母菌、根曲霉、青霉４种微生物的混合发酵作用下随着茶叶发酵过程的进行，茶叶中多酚含量呈明显的下降趋势。茶叶在未接种自然发酵的条件下，茶多酚含量呈下降趋势，但是下降趋势较缓慢。处理１相对于处理２与处理３来说，茶叶发酵过程中多酚含量下降的较缓慢，虽然接种的菌种量一样，但是处理１的茶叶仅接种了黑曲霉，而其他的接种了多种菌。处理２与处理３相比较，一周后处理２的茶多酚含量的下降趋势比处理３下降的速度要快，可能是黑曲霉和酵母菌在茶叶发酵中占主导地位，而在接种时，接种的总菌种量是一定的，处理２中黑曲霉和酵母菌所占的比例较大。
　　２．３ＤＰＰＨ自由基清除率测定
　　根据各样品的吸光度值，计算ＤＰＰＨ自由基清除率，如图２所示。由图２可知，从总体上看，在发酵初期，各处理提取液样品对ＤＰＰＨ自由基的清除率逐渐升高，发酵到９ ｄ以后，样品对ＤＰＰＨ自由基的清除率急剧下降。对于由单一菌种发酵的处理１来说，其发酵产物的ＤＰＰＨ自由基的清除率逐渐升高，９ ｄ达到最大值９０．９０％，之后逐渐降到发酵前的初始值８３．９９％以下。对于混合菌种接种发酵的处理２和处理３来说，在发酵后３ ｄ就分别达到最大值９０．０６％和９３．０９％，９ ｄ以后，也降低到发酵前的初始值以下。而作为对照的自然发酵处理，由于缺乏优势菌种的作用，其ＤＰＰＨ自由基的清除率增长较慢，３ ｄ达到最大值８７．１１％，然后便一直减小，至６ ｄ后便降至发酵前的初始值以下。
　　２．４还原力变化趋势
　　记录各处理样品７００ ｎｍ的吸光值，表示其还原力的大小，结果见图３。由图３可以看出，对于由单一菌种发酵的处理１来说，其发酵产物的还原力逐渐增高，９ ｄ达到最大值０．６０８，之后呈现缓慢下降的趋势。对于混合菌种接种发酵的处理２和处理３来说，在发酵的３ ｄ就达到最大值０．５９３和０．７１２，到９ ｄ以后，逐渐降低到发酵前的初始值０．４８９以下。而作为对照的自然发酵的处理，由于缺乏优势菌种的作用，其还原力增长较慢，６ ｄ达到最大值０．５１８，之后便降至发酵前的初始值以下。这说明随着发酵过程的继续，样品提取液的还原力在不断地发生变化，各处理样品的还原力先增大后减小。这与ＤＰＰＨ法测试结果相一致。
　　３结论
　　从普洱茶中分离纯化得到的菌种有黑曲霉、根曲霉、青霉和酵母菌，这与方祥等［6］的研究结果一致。本研究中，茶叶在发酵过程中，不同的菌株对茶叶的发酵效果不同，多酚的含量随发酵时间的增加而降低，其发酵产物的抗氧化能力随时间的增加先增大后减小。其中接种两种菌（黑曲霉、酵母菌）和接种４种菌（黑曲霉、酵母菌、根曲霉、青霉）的茶叶中多酚含量变化趋势明显，分别降低了８２．９３％和７６．４１％。在接种量相同的条件下，接种黑曲霉、酵母菌的茶叶在发酵过程中，多酚含量下降的速度较快。其中接种黑曲霉，其发酵产物的ＤＰＰＨ自由基的清除率和还原力在发酵后9 d达到最大值，而自然发酵样品的抗氧化能力却缓慢增加至最大值而后迅速下降。接种有黑曲霉、酵母菌2种和黑曲霉、酵母菌、根曲霉、青霉4种混合菌种的样品，能够在３ ｄ的发酵期内达到ＤＰＰＨ自由基的清除率和还原力的最大值，并且保持到９ ｄ后才下降到初始值之下。这说明茶叶发酵产物的抗氧化性不仅与多酚的含量有关，而且和多种菌种共生协同作用有关。本研究通过接种不同的菌种，初步揭示了茶叶发酵过程中多酚的变化规律及提取物抗氧化活性变化趋势，这为进一步深入研究茶叶人工发酵菌种的选择和开发利用其抗氧化性产物奠定了基础，为生产优质、安全、质量统一的发酵茶提供了理论依据。
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